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[流式分选] 流式分选得的细胞和机子显示差太远,连续好几次都这样

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发表于 2024-11-27 04:03:49 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏1流星未解决
你好,我用6只5周左右小鼠制备肺组织单细胞悬液后流式分选出先天淋巴样细胞(ILCs)去细胞培养,用的是BD公司的流式分选仪分选,用5毫升流式管装1毫升20%FBS完全培养基接细胞的(之前也用过纯血清)这次上之前也润了一下管子,能看到细胞打到正中央,液面也上升,分选差不多满了就吸到15毫升离心管中(每次大概25分钟),6只老鼠大概分选2个半小时结束,全部分选得细胞加起来是4.4x10^6(机子显示),可是回来用湘仪离心机1500rpm. 10分钟离心后,手动细胞计数只有5次方(确定已经混匀了),至今不知道什么原因为什么细胞突然从6次方变成5次方。分选回来还没离心之前,也取了计数看,只看到零零星星细胞,离心后取上清去看,没有细胞,确实被离心下来了,不知道细胞是不是被离碎掉了(没有细胞碎片)。问了分选老师,是不是就是分选机子出了问题,老师说没有问题,前面同学用也没出现这样的问题。请问有人出现过这样的问题吗。是怎么解决的呢。万分感谢


有液面上升

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就分选一个细胞

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圈门策略CD45+LIN-CD127+

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离心机

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发表于 2024-11-27 08:19:59 | 显示全部楼层
分选的问题,需要请马老师@Fusca  帮忙回答一下了
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发表于 2024-11-27 21:26:00 | 显示全部楼层
本帖最后由 Fusca 于 2024-11-27 21:33 编辑

感觉圈门应该没有什么问题,按照一些标准操作指南,PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好,但一般不会对结果造成实质性的影响。

但感觉如果你的分选窗口一直维持你照片里的样子,说明振幅是有问题的。如我红圈里圈选所示,在你只分选一群的情况下,你的分选液滴出现了两个,而且大小基本一致,如果一直维持这个状态,你可能有50%的细胞都在电极板加压偏转的这一步中损失了,可能会造成你的细胞损失问题。

这是你的图中的侧液流状态: 屏幕截图 2024-11-27 185027.jpg
D:\Users\user\Desktop\屏幕截图 2024-11-27 185027

这是正常的侧液流状态 微信图片_20241127185950.jpg


可以看到,正常情况下,每一个侧液流点对应一路分选,而你的液流明显出现了分群的现象,如果在分选中一直处于这样的状态,test sort也能看到这个的话,说明电极板结盐比较严重(擦一下电极板)或者是2nd-4rd drop value不是最佳,这个负责分选的老师应该可以处理的。

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 楼主| 发表于 7 天前 | 显示全部楼层
好的,谢谢老师
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发表于 3 天前 | 显示全部楼层
马老师的解答提到的问题应该是影响结果最主要的问题。
还有一个小问题,对结果影响应该不大:一路及两路分选一般会建议选择双路分选模式,使用15毫升收集管收集;三路及四路分选才建议使用4路分选,使用流式管收集。
还有如果方便的话,下次分选结束后可以把得到的收集细胞上机再看一下,可以看看分选目的细胞的纯度以及大概的细胞量。
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发表于 前天 15:55 | 显示全部楼层
本帖最后由 Akashi 于 2024-12-3 15:57 编辑
Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题,按照一些标准操作指南,PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好,但 ...

您好,我们近期做单路分选时出现test sort正常、但开始分选后液流散开的情况,清理电极板和喷嘴超声均未能改善,请问您知道造成这种情况的可能原因有哪些吗?谢谢!
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发表于 前天 15:57 | 显示全部楼层
Fusca 发表于 2024-11-27 21:26
感觉圈门应该没有什么问题,按照一些标准操作指南,PerCP Cy5.5 vs APC的那个门不要圈到坐标轴以下更好,但 ...

请教老师一个问题:2路分选时,调节液流是将靠近外边的液流和靠近中间的液流拉在一起、重合为一个液流,还是将靠近外边的液流拉开?
换个问法是最边上voltage slider拉到0还是拉开?
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