外周血PBMC流式分析Th1、Th2、Th17、Treg比例，分群不明显，结果是否可用

pjq

单染管分群不明显（FITC和APC cy7没染上，可能抗体少了），有阳性细胞，按照10的3次方以外圈门，Th2有45个，Treg有149个，Th17有177个，Th1有3123个。如果不用封闭抗体，没有同型抗体，没有染死活，现在这个结果是否可以用？抗体浓度（目前抗体用1：50稀释）或细胞量（目前能收到大约500,000个events）是否需要调整？

niwanmao

你这里每个通道究竟标记了什么抗体，全都不标的？这种情况很容易被质疑的，流式原始数据的审查现在很严格，在获取的时候就需要把各个通道的标记都标识清楚很重要

不管你的抗体是怎么分配的，若胞内因子染色没有明显分群，肯定是不对的，需要重新找一下刺激条件、染色条件

pjq

感谢，通道已标记。请问我胞内的那几个因子（对应通道APC，IFN，PE，PEcy7）算分群了吗？
我的刺激条件：96孔板每孔10的6次方个细胞，加200ul培养基含50ng/ml PMA，1ug/ml 离子霉素，10ug/ml BFA，37度刺激4.5h，应该没有问题。
IFN和IL-17还有Foxp3感觉都染上且有分离出来，但可能是目标细胞量少，所以视觉上没有聚集成团？按照收的细胞量算目标细胞量也差不多达到理论下限，但IL-4（Th2）不应该这么少，我考虑再单独提高这一个抗体浓度，不知道这样分析是否合适？

niwanmao

pjq 发表于 2025-3-8 22:47
感谢，通道已标记。请问我胞内的那几个因子（对应通道APC，IFN，PE，PEcy7）算分群了吗？
我的刺激条件：96 ...

图上的坐标确认是对的吗？CD45+的细胞几乎都没有吗？

pjq

坐标轴已确认。CD45和CD4的细胞几乎没有我猜测是我染色操作问题，这次直接吸取的0.25ul（50ul体系）可能没吸上来，之前是吸取的0.5ul（100ul体系）是可以染上去的。

niwanmao

pjq 发表于 2025-3-9 11:26
坐标轴已确认。CD45和CD4的细胞几乎没有我猜测是我染色操作问题，这次直接吸取的0.25ul（50ul体系）可能没 ...

胞内因子刺激后，会有很明显的分群，我认为结果不可信

尤其是你这里如果CD45、CD4都没有加好抗体的话，其它抗体我相信也存在问题

pjq

好的，谢谢倪老师，我再试试延长刺激时间到6h