OMIP-107：8色流式方案检测猪淋巴细胞亚群和单核细胞

niwanmao

猪不仅是重要的经济畜牧物种，更是人类疾病研究和药物毒理学的理想大型动物模型。其生理结构与人类高度相似，免疫系统也具备可比性。不过猪外周血中γδ T细胞比例显著高于人类（可达20%-50%），且在抗感染和疫苗响应中起关键作用。

然而，猪免疫研究的瓶颈在于缺乏商业化试剂：  
- 多数抗体需二次标记或实验室自行共轭，导致跨实验室结果难以比较。  
- 关键标记（如γδ TCR、CD79α）抗体无荧光素标记或需破膜处理，操作复杂。  
- 传统流式方法依赖FSC/SSC参数区分细胞，但猪单核细胞与淋巴细胞散射特性重叠，易误判。  

为此，Riccardo Arrigucci等人开发了首个8色全血流式组合（OMIP-107），仅使用市售荧光抗体，无需二次标记，可同时分析：  
- 淋巴细胞亚群：CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+CD8α+记忆T细胞、γδ T细胞、B细胞、NK细胞  
- 单核细胞：通过CD14+标记区分  

方法
1、样本制备与染色  
- 样本类型：新鲜猪全血或外周血单个核细胞（PBMC）。  
- 裂解与洗涤：采用“裂解不洗涤”策略（Lyse-no wash），通过1次离心去除裂解红细胞，减少细胞损失。  
- 抗体组合：8色抗体直接标记，避光孵育15分钟。  
- 死细胞排除：使用Live/Dead Aqua染料标记死细胞。  



2、流式细胞仪设置  
- 仪器要求：支持3-4激光（紫、蓝、黄绿、红）的常规流式细胞仪。  
- 荧光补偿：使用单染样本或补偿微球（bead）调节。  

3、设门策略
- Time门：排除流速不稳定导致的信号波动。  
- 单细胞门：FSC-A vs. FSC-H排除粘连体。  
- 红细胞排除门：结合FSC/SSC和荧光信号（如CD45或DNA染料）区分有核细胞。  
- 活细胞门：Live/Dead Aqua-排除死细胞。  
- 白细胞分群：  

• CD172α+：单核细胞/粒细胞（SSC-H较高）
• CD172α-：淋巴细胞
  

- 淋巴细胞亚群：  

• T细胞：CD3ε+ → 分为αβ T（TCRγδ-）和γδ T（TCRγδ+）
• αβ T细分：CD4+CD8α-（初始T细胞）、CD4+CD8α+（记忆T细胞）、CD8α+CD4-（细胞毒性T细胞）
• 非T细胞：CD21+（B细胞）、CD8α+CD3ε-（NK细胞）
  

- 单核细胞：CD172α+群体中CD14+细胞。  



一些结果说明  
- γδ T细胞检测：MAC320抗体覆盖约78%的PGBL22A+或PPT-16+ γδ T细胞，剩余22%可能为CD2-CD8α-亚群。  
- B细胞标记：CD21在70%的CD79α+细胞中表达，可区分成熟度（CD21+为成熟B细胞）。  
- NK细胞识别：通过CD8α弱表达与CD3ε-联合标记，避免与CD8+ T细胞混淆。  
- 绝对计数：通过双平台法（血液分析仪+流式比例）实现，变异系数（CV）<10%。  
- 兼容性：适用于全血或PBMC，50000个事件即可完成分析。  
- 扩展性：可作为基础方案，添加CD27等标记进一步细分记忆T细胞。  

局限性  
- γδ T亚群：MAC320无法检测CD2-CD8α-亚群，需结合其他标记。  
- B细胞：CD21可能漏检部分未成熟B细胞（CD21-）。  

参考文献：Arrigucci R, Patterson A, Dube P. OMIP-107: 8-color whole blood immunophenotyping panel for the characterization and quantification of lymphocyte subsets and monocytes in swine. Cytometry A. 2024;105(10):737-740. doi:10.1002/cyto.a.24897