不同激光器下滤光片相近，是否会存在补偿

白攸远

hurunhuan

白攸远 发表于 2025-6-12 19:45
1. 488 下的Bv605和561下的mcherry之间会有补偿的原因？

1. 看激发光谱，mcherry在这2个激光器下均能激发。常见染料的激发/发射光谱，几个流式大厂都有工具可以查看。BD的在这里：https://www.bdbiosciences.com/en-us/resources/bd-spectrum-viewer
2. 是同样的滤光片。
      实际上，在设计过关的情况下，只需要看激发光谱，染料是否可以被对应激光器激发，能激发就有补偿。
测试仪器设计是否过关的方法很简单，将相应的激光器关闭/使用挡板遮住或者功率降到极低（<<1mW），因为有的仪器会检测激光器状态，检测到激光器关闭就会关闭对应通道。
      然后上样本/微球，看关闭的这个激光器的对应荧光通道有没有信号升高的情况，就知道仪器设计是否有缺陷。
      理论上一个激光器的通道不可以收到其他激光器激发的散射光信号，但是实际上，多少会收到一些，某些离谱的仪器会收到非常多其他激光器激发的散射光信号，甚至8peaks微球的峰都能跑出来。
      设计不过关的仪器跑简单染色（比如20色仪器跑6-8色优选过的panel）看起来会很正常，但是上了10色，那跑出来的图就会非常奇怪。还觉得是自己实验做的有问题，所以遇到实验图不正常，首先换质控过关的大厂仪器跑一下。再检讨实验问题。。。

白攸远

1. 488 下的Bv605和561下的mcherry之间会有补偿的原因？


2. 另外还想请教下YL4和RL3是同一个滤光片吗？

hurunhuan

以红色激光器通道为例，画了光线传播方向。这张图展示了接受通道的排布状况。

niwanmao

mCherry和BV605从发射波长看，两者是有重叠的，共用滤光片肯定会有问题，但是我看这里的光路和滤光片似乎是分开的，是不是还是可以用的？   @hurunhuan  站友非常专业，请指点一下

hurunhuan

niwanmao 发表于 2025-6-13 07:44
mCherry和BV605从发射波长看，两者是有重叠的，共用滤光片肯定会有问题，但是我看这里的光路和滤光片似乎是 ...

       这个涉及到光路设计问题，大部分流式的光路都是独立激发（每个激光器一个检测点），独立接收（可以理解为每个检测点一路收光系统）的，所以滤光片的型号虽然一样，但是是2个滤光片，2路接受的。
       共线激发（激光器一个焦点），共线接收的仪器应用比较受限，荧光素选择会受限。
       也有部分仪器是独立激发，共线接收，比如安捷伦的部分机型。这个可以节约探测器成本，但是对于信号处理要求比较高，要将不同时域（时间）的激光器散射光信号区分开来。原理就是微粒通过不同的激光焦点会有时间差，通过时间差（看样本流速，一般是us级别）来分离信号。
       回到问题，这台仪器是可以同时用mCherry和BV605的，就是如果追求图形完美漂亮的话，会需要调一些补偿。




共线激发和平行激光/图片来自赛默飞 https://www.thermofisher.com/hk/ ... flow-cytometer.html


共线接受系统/图片来自 NovoCyte说明书

Yuck

hurunhuan 发表于 2025-6-13 09:02
这个涉及到光路设计问题，大部分流式的光路都是独立激发（每个激光器一个检测点），独立接收（可 ...

怪不得同配置要求安捷伦设备便宜很多。那这种共线接受的滤光片，理论上是最好不能同时使用488、640来激发的检测650长通片？只是因为他通过算法优化，导致可以使用了？

hurunhuan

Yuck 发表于 2025-6-16 17:32
怪不得同配置要求安捷伦设备便宜很多。那这种共线接受的滤光片，理论上是最好不能同时使用488、640来激发 ...

只有共线激发的，不能同时使用488、640来激发的检测650长通片。
独立激发，共线接受问题不大的。只要算法处理好，这样的仪器的上样事件速度略低一些而已，只要上样速度到不了几万events/s，基本上不太会出现错误。
因为单个细胞通过激光焦点的时间要远远小于通过2个激光焦点的时间的，再加上细胞足够稀，很久才有下一轮信号，所以实际上的解析难度并没有想象中的高。