先裂解还是先染色？电压增益

Emmert

图一：

图二：
前提：
样本来源：小鼠脾脏细胞
操作步骤：淋巴细胞分离后先在15ml 离心管中裂红再转移细胞到流式管中染色的
仪器设备：艾森流式3000 3激光13通道
目标细胞群：小鼠Tfh、TCM与TEM
请假各位两个2问题：
图一中细胞在去碎片后呈现的红圈中的3群细胞来源可能是什么操作导致？是倪老师前段时间发帖说的裂红步骤有误导致的吗？
图二中CD8T细胞为什么会有一群负值的细胞群？并没有对CD8——APC通道进行补偿调节

hurunhuan

图1 的红圈内细胞是粘连细胞，上样速度过快也会有概率导致这样的数据。
图2的细胞，是显示问题，实际上跟正上方细胞应该是一群（比如-10到+10之间改成线性显示，看起来就是一群了）。 有负数的原因，是因为信号值比荧光通道设置的baseline高，但是比荧光通道的threshold低，所以是负值，可以通过调高电压调回来。
原理大概是这样的：
一般流式以FSC为触发信号，只有当信号比FSC的threshold高，才会记录为事件，但是这个记录的事件有可能比荧光通道设置的threshold低，所以就显示为负值。
之所以荧光通道还需要threshold，是为了降低仪器的MESF值（这就是MESF无法准确表征仪器性能的原因。），如果荧光通道的threshold乱扣，可能微球测的MESF会非常漂亮（比如低于50等），但是这样的仪器跑实际细胞样本，就会出现奇奇怪怪的数据。
所以有时候使用非主流厂家仪器出现异常，首先拿主流厂商（当然，安捷伦也是主流厂家之一啦）QC性能正常的仪器测一轮，排除仪器问题之后，再来检讨实验问题。

Emmert

收到，谢谢。我觉得就是电压增益调低的原因。