小鼠肠道的免疫细胞凋亡检测

chen_yiqian

分离小鼠体内免疫细胞进行流式分析时，一般会先圈死活，因为死细胞会有非特异性着色和自发荧光，干扰流式结果。

但是如果是要分析某种免疫细胞在体内的凋亡，如果先圈了死活，那就有问题了。如果不圈死活，直接标记后续的抗原来确定细胞类型（比如CD3+CD4+T细胞的在小鼠体内的凋亡情况），再在该细胞类型上圈Annexin V和PI，这样得到的结果可靠吗，或者这是常规的检测小鼠体内的免疫细胞凋亡的方法嘛？

chen_yiqian

或者说标记Annexin V和Zombie。

niwanmao

你的意思是希望同时标记凋亡标志物和表面抗体是吧？

我记得有两种可能的实现方式：
1、用抗磷脂酰丝氨酸抗体替代Annexin V去标记PS反转，用活性胺染料（像你说的Zombie）替代PI，这两种标记物跟抗体一起染，这种方法我觉得最推荐吧。
2、先用Annexin V缓冲液染好Annexin V，然后洗涤后再标记抗体，上机前再染1-2分钟PI？这个只是我推测的可能，需确认一下实践的可行性

chen_yiqian

niwanmao 发表于 2025-7-17 09:00
你的意思是希望同时标记凋亡标志物和表面抗体是吧？

我记得有两种可能的实现方式：

倪老师好，我可能没写清楚，是这样的，我想问2个问题：
1. 死细胞可能会非特异性结合抗体，所以我们才会在一般的流式分析中，先圈死活，然后对活细胞的比例进行分析。但这种凋亡检测本身就检测死细胞的比例，流式圈门的顺序应该是去粘连-细胞表面marker-Annexin V/Zombie，那这样前面圈表面marker确定细胞亚群的时候，就可能受死细胞的影响，圈到了一些别的亚群的死细胞（非特异性结合目的细胞的marker），导致晚凋/死亡细胞比例偏高？所以想问一下，文献里那些凋亡实验共染Annexin V/Zombie和表面marker是怎么做的。

2.您回复中提到的，为什么要用抗磷脂酰丝氨酸抗体替代Annexin V去标记PS反转？是因为使用Annexin V会在后续表面marker的染色过程脱落吗？

chen_yiqian

niwanmao 发表于 2025-7-17 09:00
你的意思是希望同时标记凋亡标志物和表面抗体是吧？

我记得有两种可能的实现方式：

而且是不是使用Annexin V或者抗磷脂酰丝氨酸抗体标记，不建议进行破膜后同时标记胞内的标志物，因为会导致表面的Annexin V或者抗磷脂酰丝氨酸抗体信号显著降低。但这个图片里面检测Treg标记了Foxp3，感觉很困惑老师，求解答。

niwanmao

chen_yiqian 发表于 2025-7-17 10:11
倪老师好，我可能没写清楚，是这样的，我想问2个问题：
1. 死细胞可能会非特异性结合抗体，所以我们才会 ...

设门顺序得看你的分析目的，如果想分析某个亚群的凋亡情况，可直接圈该亚群，再分析其凋亡情况。  死细胞没你想象的那样很强的荧光，主要是一些非特异性荧光，能分

用PS抗体标记，是因为Annexin V和抗体一起标记，两者需要的染色条件不同。

你那个文献的图，Annexin V/PI 和后面的FoxP3应该不是同一管染色的吧，看一下文献的方法学部分