中性粒细胞 全血染胺类活性染料及抗体孵育步骤

正安

老师们好，

       请问有没有适合全血免洗涤的胺类染料（很少受血浆影响的），计划步骤是人外周血 全血 100ul --免洗涤直接加胺类染料孵育--加等体积的含FBS的PBS--加FC block孵育 10min--转移样品到含50ul Brilliant Stain Buffer与多色抗体的混合体系的新流式管--室温孵育 30min--加BD FACS™ Lysing Solution 1ml 10min 裂红及固定--洗涤上机。做的中性粒细胞，比较容易损伤及激活，求步骤改进意见。
       谢谢老师！

正安

要是洗涤的话，人外周血 全血 100ul --2ml PBS 200g 5min--倾倒上清（尽量不倒掉细胞）--加胺类染料孵育10min--加等体积的含5% FBS的PBS中和FVS染料--加FC block孵育 10min--转移样品到含50ul Brilliant Stain Buffer与多色抗体的混合体系的新流式管--室温孵育 30min--加BD FACS™ Lysing Solution 1ml 10min 裂红及固定--洗涤上机。是否可行？

niwanmao

1、尽量采集标本3小时内完成染色和裂解。
2、在4℃下孵育，减少中性粒细胞应激活化。
3、可考虑使用更高浓度的 Viobility™、LIVE/DEAD™ 或 Zombie™ 染料（例如，Viobility建议每 100 μL 全血中加入 1 μL 5× 储存液），可避免受血浆蛋白的影响
4、胺类染料结合后，加入等体积的含 2% FBS 的冷 PBS进行Fc阻断。
5、加入 Brilliant Stain 缓冲液、抗体，在 4°C下孵育 30 分钟

其它步骤如你所述

正安

谢谢倪老师