流式圈门问题

Nicoctor

站里各位大大，之前发帖有回复说不同组织来源细胞需要采取不同的圈门策略，最近流式圈门的时候遇到几个问题，想请教一下
1. 使用脾脏免疫细胞做了巨噬 F4/80 FMO管 (图1)

F4/80 FMO管

依据该管去圈巨噬细胞的时候，发现外周血里面也有百分二十几（图2）

外周血F4/80圈门

这一群是表达F4/80 的单核细胞吗？



2. 圈死活的时候，大部分样本的细胞形态是比较一致的，比如外周血（图3）

外周血死活

脾脏（图4）

脾脏死活

组织消化分离的免疫细胞虽然形态不一样，但是按照上述阈值去圈门总体还是能圈到的（图5）

组织消化分离免疫细胞死活

但是有个别的样本形态就差得很多，比如图6

异常死活形态1

图6中的活细胞圈取是不是得把门往上移，比如这样

异常死活形态2

这样子的话，各个样本中的死活信号阈值就不一致了，感觉也不太合理，还是说确实在该样本中只有15.7%的活细胞？并且我如果把门往上移动，后面细胞的比例都变得有点奇怪（该样本为WT型，理论上无转基因荧光信号，门移上去后，阳性比例就特别高，这也是我觉得把门移上去后不合理的地方）
希望站内大佬赐教

niwanmao

这种强度上的差异，通常跟样本中的细胞密度有关，细胞数量上的差异，会出现染色强度上的波动。

在这种分群明显的情况下，FMO退居次要位置，以分群界限为准

如果遇到分群不明显的情况，务必把各个标本细胞密度调整一致之后，再染色，再用FMO确认门的位置

司徒随风

表达F4/80 的单核细胞，也可能是非特异性结合，有做封闭吗，用的什么封闭剂，效果稳定吗？
确实在该样本中只有15.7%的活细胞，这个是可能的，如果实在是拿不准，您可以制备一份死细胞，把细胞固定破膜一下，染死活，确定死细胞群，再去反圈活细胞。

Nicoctor

司徒随风 发表于 2025-11-26 11:16
表达F4/80 的单核细胞，也可能是非特异性结合，有做封闭吗，用的什么封闭剂，效果稳定吗？
确实在该样本中 ...

封闭有的，Bio的FCx，组内一直用这个，应该还可以

Nicoctor

niwanmao 发表于 2025-11-26 08:23
这种强度上的差异，通常跟样本中的细胞密度有关，细胞数量上的差异，会出现染色强度上的波动。

在这种分群 ...

学到了，原来细胞密度会影响染色强度。
由于该样本是从组织消化而来，所以细胞密度确实差得挺多的。