我是刚接触内皮祖细胞的，刚开始用的是全血做的，发现表达太低，就改用提取单个核细胞。
后来发现这个主题论坛有人先提取后改为全血，而且做得不错。我就很无语了。因为试剂问题，和既往很多文献都用此方法做出来过，我就坚持提取单个核细胞了。
在提取的过程中实验结果老是不理想，我把我的试验步骤发过来了，上面有很多问题，希望各位给于指点。
有些问题已经在本论坛上问过，也得到了满意的回答，有些还是不清楚，望继续指点。谢谢。
经站长建议我就另开一帖子，谢谢
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我帮你整理了一下，直接贴在这里让大家讨论更好一点，整体看了下，觉得你的问题很多很杂，有问题是对的，但是很多问题看了之后，让人感觉你很多基础知识都没有掌握！
－－－－－－－－－－－分割线－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－ 内皮祖细胞检测操作步骤及注意事项 试剂：淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物科技有限公司） 【1.18-25度保存，启封后4度避光保存避免微生物污染。2.细胞分离液自冰箱取出后，不可立即使用需待溶液温度升至室温后摇匀使用。3.分离过程中温度控制在18-28度且在无菌环境中，避免微生物污染，否则会影响分离质量】 PBS液（中国医学科学院生物医学工程研究所） 抗体 材料：10ml离心管，吸管，标记笔，流式细胞仪用检测管，试管架 100-1000ul，10-100ul，1-10ul移液器及针头 仪器：白洋B320A型医用低速离心机，振荡器，流式细胞仪 步骤： 一、分离PBMC（外周单个核细胞）
1．采样-----------用抗凝管（血常规紫管）（EDTA）收集血液2ml。
【1细胞应新鲜，避免冷冻冷藏。2血液加入到抗凝剂中和稀释血液时混匀不能太用力，否则会溶血。3出现凝集不能继续实验。4应注意安全防护，避免血源性传染病传染。】
2. 温浴----------将血标本、淋巴细胞分离液、PBS液在水浴箱中温浴8分钟。使其温度达到[22-28℃]
3．稀释血液-----充分摇匀血液样本，向抗凝管中加入等体积PBS液（1:1）稀释血液。
4. 混合--------取淋巴细胞分离液4ml，放入10ml的离心管。将离心管倾斜45°角，用吸管吸取稀释的血液，在离分离液面上1cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释的血液层叠于分层液上，保持两者界面清晰。
【注意保持清楚的界面，勿使血液混入分层液中。这是操作的关键步骤】
5．离心--------18-20℃，水平离心机以1500r/min离心18min. 离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分离液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。（离心温度在18-20度）
6.分离---------先吸去最上层的血浆，然后用毛细吸管沿管壁周缘收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，置于10ml离心管内
【作各个方向的吸取，吸取时勿使各层细胞相混。尽量全部吸出PBMC，避免吸到过多的分层液和血浆。】
7. 离心--------向单个核细胞中加入５倍（约5ml）的PBS液手动旋转使液体混匀，离心洗涤2次，依次以2000r/min、1500r/min离心各10min，吸弃上清液。
【1低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板。2操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。】
二、抗体孵育
1.孵育-----取2mlPBS液于上述单个核细胞中，震荡混匀，将样本倒入流式用的检测管内，加入抗体 ，暗室孵育20分钟。
2.离心-----1500r/min，5min离心一次后，弃上清。
3.上机检测-----若能及时检测，可加入1mlPBS液 震荡混匀，上机检测。
若不能及时上机检测，用1%的多聚甲醛500ul固定标本24小时内上机检测。
下面是楼主的问题：
1、淋巴细胞分离液
最好的是进口的singer分离液，我们购买的是天津市灏洋生物科技有限公司的，实验是否受影响？
2、抗体
我们订购的如下--
| | | | | 货号 | 抗体 | 规格 | | 555821 | CD34-FITC | 100T | | 555748 | MS IGG1-FITC | 100T | | 130090826 | CD133/1-APC | 100T | | 550874 | MS IGG1-APC | 0.1mg | | 557748 | CD45-PE-cy7 | 100T | | 557646 | MS IGG1-PE-cy7 | 100T | | 560494 | CD309-PE(KDR) | 100T | | 554680 | MS IGG1-PE | 0.1mg | | | | 50T |
CD133不是BD的，是美天妮的，实验是否受影响？
3、同型对照
有的说可以用其他病人的血作同型，有的说应该用同一病人的新鲜血作同型。应该怎么办？
2.血标本---新鲜？
我既往做的同型均是用检验科做完血常规后的血做的，而病人的血则是刚抽出来的。
血标本一定要新鲜是吗？无论是检测管还是同型管？
4、离心
实验经过5次离心，每次离心的转速，时间有的是看文献的有的是自己摸索的。
----究竟是多少望给与指导
5、吸取单个核细胞
没见过别人分离完后出现的白膜层是什么样的？应该怎样吸？吸多少？
我既往做的也是靠感觉，不是道究竟应该吸多少？吸到什么程度？
-----望既往做过的老师给与指导。
6、加入多少pbs混匀洗涤，文献上说是5倍。
7、离心后离心管底有沉淀细胞，
文献上说用吸管洗去上清液，不知吸到什么程度，是只剩下细胞还是剩点液体？
有的说可以直接倒掉上清液，但倒完后总会有一些液体倒不出？
----------------细节问题望给于指导
8、抗体孵育
有的说用2ml PBS液加入离心后沉淀的细胞中制成混悬液，加入抗体孵育，我以前也是这样做的。
有的说这是完全错误的，应该加100-150ul（具体没细说多少）PBS制成细胞悬液。
后抽取上述悬液80ul（她们是80ul，具体用多少没细说）加入抗体孵育，抗体和细胞悬液总量应是100ul。
9、我用的是振荡器混匀细胞的，这样会不会导致细胞碎片产生，或者使细胞死亡？应该怎样混匀？
10、抗体量
有的说除cd133是10ul外，其他全是20ul，（以后实验成熟后再调）
有的说她们都加10ul。
11、抗体孵育温度
有的说他们孵育抗体在室温
有的说在室温20分钟，后让我改成25分钟孵育。后考虑到CD133的说明书上要求在冰上或4度的冰箱中孵育。
究竟应该怎样望指导
12、上机检测
加500ul pbs上机检测
收集细胞过程中感觉量太少，老怕一会就走完
13、多聚甲醛配置
文献上说应调节ph，而既往因没有NaoH就没调ph。可能影响实验】
14、多聚甲醛固定
石强说可以多聚甲醛固定，在24小时内上机检测。有的说刘老师说她们都是立即检测，不用固定。
用多聚甲醛固定后，感觉在fsc-ssc中多出来一团细胞？是细胞凋亡？还是多聚甲醛污染？
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发表于 2011-11-28 20:48:05
发表于 2011-11-28 20:48:06
BS+EDTA+BSA）
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