细胞周期检测应该用哪种RNase？

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-2 10:45:28

我做周期时用的是碧云天公司的RNase（用PBS稀释成1mg/ml）进行细胞孵育（37°），没想到细胞居然变成了碎片，公司答复说我买的这款RNase主要用于质粒和基因组抽提，难道细胞周期检测所用RNase有特殊性吗？我想买Sigma公司的RNase干粉，现在也不敢下手了，怕万一买回来用也是这种结果怎么办啊？所以请有经验的朋友能帮我分析一下原因，并告诉我你们都选择的是哪些公司或哪种规格的RNase，万分感谢，盼复。

gcz5340 · 发表于 2012-4-2 11:36:40

我们一直用sigma的RNase A，货号R6513，没出过什么问题。
我不知道你说的细胞碎了是什么意思，是上机的时候没有细胞呢还是都位于FSC/SSC的左下角没有典型的周期峰，这个也可能与你细胞状态或者固定步骤有关系，如果是这些问题，你换了RNase同样还是一样的结果。

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-3 12:54:15

本帖最后由蓝白小熊于 2012-4-3 12:56 编辑

gcz5340 发表于 2012-4-2 11:36

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我们一直用sigma的RNase A，货号R6513，没出过什么问题。
我不知道你说的细胞碎了是什么意思，是上机的时候 ...

谢谢你，我固定之后用PBS洗涤两次，然后取了一滴滴在玻片上看，细胞形态是很完整的，而且大部分是单细胞，然后我用RNase孵育30min，染PI30min，上机，FL2-W和FL2-A那张图根本就出不来典型图像，全是密密麻麻的点，也就更谈不上什么典型的周期峰了，然后我又取了一滴样品在镜下观察，根本就没有细胞，全是一些细胞碎片，所以我也很迷惑，你能帮我分析一下原因么，谢谢。

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-3 12:55:28

蓝白小熊发表于 2012-4-3 12:54

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谢谢你，我固定之后用PBS洗涤两次，然后取了一滴滴在玻片上看，细胞形态是很完整的，而且大部分是单细胞 ...

然后我就又取了一滴样品滴在玻片上，镜下观察，根本就没有什么细胞啦，全是一些细胞碎片

niwanmao · 发表于 2012-4-3 13:14:51

蓝白小熊发表于 2012-4-3 12:54

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谢谢你，我固定之后用PBS洗涤两次，然后取了一滴滴在玻片上看，细胞形态是很完整的，而且大部分是单细胞 ...

30分钟有点长的，PI你是多少浓度？

我建议你用这个方法试试，把RNA酶和PI合起来配成工作液，作用15分钟即可：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=1330

gcz5340 · 发表于 2012-4-3 15:30:41

或者弄一管不加RNA酶的，不加RNA酶其实也可以，就是CV会大一点，如果不加RNA酶的做出来有细胞，就可以判定是RNA酶的问题了。

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-5 18:57:00

niwanmao 发表于 2012-4-3 13:14

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30分钟有点长的，PI你是多少浓度？

我建议你用这个方法试试，把RNA酶和PI合起来配成工作液，作用15分钟 ...

非常感谢，PI我用的是50ug/ml，4°放置，一般放15min左右就上机，PI我觉得应该没问题，因为我之前都是用的这个，一直没出问题，RNase一换问题就来了，只有两个字“郁闷”

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-5 18:59:27

gcz5340 发表于 2012-4-3 15:30

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或者弄一管不加RNA酶的，不加RNA酶其实也可以，就是CV会大一点，如果不加RNA酶的做出来有细胞，就可以判定 ...

BD的老师跟我说不加RNase的话，结果是不准确的，而且Modfit软件分析不出来。我有位同事就没加RNase试了一次，出现两个问题：1、细胞收集很慢，3万个细胞大概要收7-10min左右；2、图形也不漂亮，没有典型的周期图形

niwanmao · 发表于 2012-4-5 21:01:49

蓝白小熊发表于 2012-4-5 18:59

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BD的老师跟我说不加RNase的话，结果是不准确的，而且Modfit软件分析不出来。我有位同事就没加RNase试了一 ...

是同时做不加RNAse和加RNAse两组的标本吗？RNAse不至于影响细胞获取的，只是对结果可能会有影响。

蓝白小熊 · 发表于 2012-4-6 08:12:14

niwanmao 发表于 2012-4-5 21:01

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是同时做不加RNAse和加RNAse两组的标本吗？RNAse不至于影响细胞获取的，只是对结果可能会有影响。 ...

没有做两组对比，但是相同条件的细胞，同时做凋亡和周期，凋亡收集特快，周期收集就慢得不得了，不知道是什么原因呢？

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