补偿和荧光强度有关系吗？

gcz5340

我总觉得补偿和荧光强度没有关系，比如做FITC/PE双标试验时，都是先上单标调好补偿，然后只要电压不变，就以该补偿值跑后面的sample管。但这两天听到好几个人跟我说补偿和荧光强度有关系，如果荧光强度有变化，补偿也要改变；还有人说不通公司的抗体，每个抗体上结合的荧光素量不通，荧光强度就有变化，补偿要重新调。

请有经验的战友来解答下，我以后工作中也会注意观察一下。

niwanmao

我认为，不应该是跟荧光强度有关，而是跟电压有关。他们说的跟荧光强度有关可能是一种错觉，应该是补偿未调节到位缘故。
以我下面画的这个图为例，我觉得他们平时调节可能用表达比较弱的细胞来调节补偿（如下图中的黑圆形），这时看似已经调节好补偿了，但实际上如果以这个补偿值上一管高表达这个标记的细胞，可能就是未调节到位的状况（如下图的虚线）。所以他们认为与荧光强度有关。因此，我认为是他们的一种误解，只能说是原来的补偿可能是未调节到位，所以导致上高表达的细胞时，才暴露出不到位的情况。
所以，我建议大家在平时调节补偿时，尽可能使用高表达某抗原的细胞来调节，这样更好，如果实在找不到高表达的，可以采取一个妥协的方法，就是用相同荧光的其它抗原来调节。
供参考，欢迎大家积极讨论指正。

补偿调节示意

haven_t

在瑞金讲10色免疫表性分析的老外和刘老师曾经和探讨过这个问题，老外很保守，认为会有一点差异。而我并不这样认为，看看以下两个图就会知道为什么他们有这样的结论。

gcz5340

haven_t 发表于 2012-7-4 12:37

                               
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在瑞金讲10色免疫表性分析的老外和刘老师曾经和探讨过这个问题，老外很保守，认为会有一点差异。而我并不这 ...

这个有点奇怪，似乎这两个样本CD45 APC荧光强度差的也并不是很多，补偿差的也太多了，那岂不是以后多色实验的时候每个Sample管都要独自做单标调补偿？
我觉得APC和偶联APC-Cy7可能说明不了问题，回头找找以前的结果来看看。

niwanmao

haven_t 发表于 2012-7-4 12:37

                               
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在瑞金讲10色免疫表性分析的老外和刘老师曾经和探讨过这个问题，老外很保守，认为会有一点差异。而我并不这 ...

这两幅图的APC-CY7的电压是不是不同？
如果按照那个补偿的教程看，应该选择下面这幅正确，但从自己平时的习惯来说，更倾向上面这幅，不过上面这幅如果我来做，我需要把补偿再稍微调大一点点，让绿色和紫色稍微下来一点点就完美了。

haven_t

gcz5340 发表于 2012-7-4 13:12

                               
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这个有点奇怪，似乎这两个样本CD45 APC荧光强度差的也并不是很多，补偿差的也太多了，那岂不是以后多色实 ...

不是哦，这是同一个标本，准确来说是同一个数据（包括补偿矩阵），不同的只是显示的坐标而已。

haven_t

niwanmao 发表于 2012-7-4 14:30

                               
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这两幅图的APC-CY7的电压是不是不同？
如果按照那个补偿的教程看，应该选择下面这幅正确，但从自己平时的 ...

不错，就是如此，但大家似乎忽略了那个教程的图上是线性坐标，而不是对数坐标。假如换成是对数坐标的话就是第一张图的情况了，所以不要认为第一张的补偿是有问题的，其实两张图完全一样，包括补偿值。

niwanmao

haven_t 发表于 2012-7-4 14:37

                               
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不错，就是如此，但大家似乎忽略了那个教程的图上是线性坐标，而不是对数坐标。假如换成是对数坐标的话就 ...

哦。原来是这样的，看来平时看资料还得再仔细点，平时只知其然，不知其所以然。受教了。

蓝白小熊

学习啦，谢谢

stef1981

我也觉得补偿跟荧光强度有关系，倪老师说的“尽可能使用高表达某抗原的细胞来调节”，那低表达的不是就补偿过了？我以前也用每个单标来做补偿，后来了解了细胞群的分布，嫌麻烦就不做单标补偿，直接上双标或三表，凭经验再来调节补偿，或只做1个单标补偿。在实验时间、成本跟实验准确度上需要经验来协调，个人看法。