绝对计数

日月星辰

我是一个流式新手，最近在做细胞绝对计数，遇到一些问题，想请教各位，在此先谢谢了~
我实验的目的，主要是测定目标细胞的数目，用的仪器是BD公司的，数据分析软件是FACSDiva version，结果如下，分别是同型对照和样本的图
拜托各位帮忙分析一下以下问题：
1.这个绝对计数的模板正确吗？自己根据说明书画的图，不知道对不对啊
2.如何根据同型对照划分阴阳界限呢？是使P2占99%为界限吗？
3.样本和同型对照做了，但不知道究竟如何比较结果啊？
4.请问cellquest和procount这类软件是不是专门用来绝对计数的啊？是不是不用手工计算，自动得出阳性的细胞啊？还有，这些软件适用于所有计数的细胞吗？

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niwanmao

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日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-9 11:37

                               
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谢谢倪老师，不过这篇帖子没有提到如何划分阴阳界限以及流式的设定方案，请问倪老师，你做绝对计数的时候是怎么做的啊？谢谢了~

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-9 13:29

                               
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谢谢倪老师，不过这篇帖子没有提到如何划分阴阳界限以及流式的设定方案，请问倪老师，你做绝对计数的时候 ...

这个应该要根据你的阴性对照来设置的。
假如你只是测这一个指标XXX，那么就可以用其对应的同型对照设置界限。

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-9 14:32

                               
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这个应该要根据你的阴性对照来设置的。
假如你只是测这一个指标XXX，那么就可以用其对应的同型对照设置界 ...

倪老师，这是我实验的结果，P2为阴性细胞，P3为阳性细胞，P4为微球量。根据同型对照使P2占总数的98%，把P2/P3/P4的位置划定，然后测定样本，按照公式：细胞量=（P3*微球总数）/（P4*样本量）。
但是，1、我不太确定这个方案对不对？
2.这样划定P2/P3/P4的方式对吗？
谢谢倪老师~

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-9 16:14

                               
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倪老师，这是我实验的结果，P2为阴性细胞，P3为阳性细胞，P4为微球量。根据同型对照使P2占总数的98%，把 ...

门的划分上，你的细胞阴性峰怎么会有3个？我个人觉得P3可以再适当往左边扩大一点，位于P2曲线延伸至X轴交叉点处。

公式是对的，但算出来应该是细胞绝对密度××个/ul
方案对不对不好说，因为不知道你做的是什么指标。

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-9 17:38

                               
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门的划分上，你的细胞阴性峰怎么会有3个？我个人觉得P3可以再适当往左边扩大一点，位于P2曲线延伸至X轴交 ...

嗯，公式算出来应该叫绝对密度。我测得标本结果的阴性峰数目都不定咯，有1个的、2个的等，是不是因为标本是体液，里面细胞种类多的缘故哦？
倪老师，由于P3的范围直接影响到最后的绝对密度，请问有没有一个标准，比如：使P2占总数或占p2+p3的比例成一个固定值？还是按照您刚才说的，使P2曲线延伸至X轴交叉？（因为就这个同型对照的图来说，P2曲线延伸部分，没有严格意义上的交叉，还是存在少量的细胞）
另外，今天我又测定了一些标本，发现同型对照和样本在P2区的峰位置以及峰形都有不同，请问在绝对计数里这能说明说明问题吗？
非常感谢倪老师

日月星辰

niwanmao 发表于 2012-7-9 17:38

                               
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门的划分上，你的细胞阴性峰怎么会有3个？我个人觉得P3可以再适当往左边扩大一点，位于P2曲线延伸至X轴交 ...

倪老师，我实在有点摸不着头脑，感谢您这么有耐心哈，惭愧....
这是我这个实验用的单克隆抗体说明书上的效果图，白色部分是同型对照，黑色部分是样本，二者的峰形以及位置很不同，而且在最右下角的地方，同样有白色和黑色的部分，请问这是该如何根据同型对照来划分样本的阴阳界限的呢？

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-10 20:48

                               
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嗯，公式算出来应该叫绝对密度。我测得标本结果的阴性峰数目都不定咯，有1个的、2个的等，是不是因为标本 ...

1、是的，细胞种类不同，可能由于其胞内颗粒度不同，会导致荧光强度不同，从而形成多个峰。不知道检测时你能否把FSC的电压稍微调低一些，使beads的位置再尽量偏左一点。
2、P2曲线延伸段与X轴交叉处作为阳性、阴性分界是我自己的经验，就是让曲线按照自然形态延伸下来，与X轴交叉点作为阳性、阴性分界。如果不用这种方法，具体划分多少，似乎不同文章有不同自己的标准，有的以0.5％以内为标准，有的以1％以内为标准，但只要是定下来，整篇文章所有的分析就都得以这个为依据

阳性、阴性划分方法

niwanmao

日月星辰 发表于 2012-7-10 21:03

                               
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倪老师，我实在有点摸不着头脑，感谢您这么有耐心哈，惭愧....
这是我这个实验用的单克隆抗体说明书上的 ...

白色是同型对照，但不是说阳性区域绝对一点白色都不会有，因为同型对照的表达率一般不可能是0％的，因为基本上每个样本都存在或多或少的非特异性染色。
我认为他们这个图的划分方法可能就是我上面这帖子中提到的定数值（0.5％以内或1％以内）。