正在做流式，而且由于实验设计问题，不得已必须要做流式，还没有直标抗体，只能做间标，问题来了：
那就是我买的一抗是SANTA的，可以做三个方面的实验：Western Blotting，immunoprecipitation和flow cytometry。荧光二抗也是用的SANTA的。
我已经做了一次，流程是这样的：
表面抗原(贴壁细胞为例)：间接免疫荧光法① 对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，调节细胞浓度1×106个/ml； ② 取1ml细胞悬液，1500rpm离心，5min，细胞沉淀重悬于100μl PBS中； ③ 加入相应检测细胞表面一抗(按说明书加，一般20μl)，混匀，室温避光放置30min； ④ 吹打悬起，PBS洗2次，1000rpm，离心5min，弃上清，细胞沉淀重悬于100μl PBS中； ⑤ 加入相应检测细胞表面二抗(按说明书加，一般20μl)，混匀，室温避光放置30min； ⑥ 吹打悬起，PBS洗2次，1000rpm，离心5min，弃上清，加入500μl PBS重悬细胞，流式细胞仪检测。
但是结果很悲催，阳性对照都没有表达，我现在能确定的是蛋白应该是表达了，但是为什么没有检测出来？
我自己想了两个假设:
一是间标的由于PBS洗的次数过多，导致最终荧光的亮度过低，通过减少洗的次数来提高亮度。
二是由于此抗体可以做Western Blotting,所以检测的是变性后的蛋白，而我的实验步骤中没有对细胞经过变性处理，所以一抗没有和天然构象的蛋白结合。应该通过添加多聚甲醛等对蛋白进行变性之后再加抗体。
不知道有没有高手告诉我一下，谢谢。 | 
发表于 2012-8-29 16:49:07
发表于 2012-8-29 17:59:50
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