多色标记抗体的流式实验要怎么设置对照？

willow2013

各位老师好，我第一次做表面抗体标记，做的是人胎盘的间充质干细胞，想选择直标抗体CD45-FITC，CD14-APC-Cy7，CD73-PE和CD105-APC，有两个问题想请教一下
1、选择这几种抗体需要设置哪些对照？
2、具体的对照要怎么设置？我看文献之说有同型对照，可以刚看咱们的论坛说还有什么补偿对照，不懂怎么回事，恳请各位老师帮忙，谢谢！

niwanmao

首先用空白对照调节电压，这部分数据可以不保存，主要是了解一下电压大概在什么水平可以使细胞出来，同时又不会跑的太外面。

然后用FMO对照调节各个通道之间的补偿：
就是一共4个抗体，依次拿掉一个，组合出4组搭配（PE/APC/APC-CY7、FITC/APC/APC-CY7、FITC/PE/APC-CY7、FITC/PE/APC），用来细调电压和通道之间的补偿。
如果你是BD的机器，由于FITC、PE这两种与APC、APC-CY7两种之间不存在补偿，我个人觉得可以只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-2-22 12:35

                               
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首先用空白对照调节电压，这部分数据可以不保存，主要是了解一下电压大概在什么水平可以使细胞出来，同时又 ...

倪老师好，我对流式了解的很少，问些问题希望您不要见笑。
您说的FMO对照的设置，即4种抗体中的3种组合，这三种抗体组合各用量是多少呢?添加时有先后吗？
只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调的话是怎么调的呢？就是每种单标抗体都设个管吗

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 12:48

                               
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倪老师好，我对流式了解的很少，问些问题希望您不要见笑。
您说的FMO对照的设置，即4种抗体中的3种组合， ...

抗体用量就按照说明书好了，标准用量，就是说本来你标本是用4个抗体一起染的，现在减掉一个，去调节其它通道漏到这个通道的荧光。
FITC单标，看看FITC到底有多少荧光漏到PE通道，即调节PE减去多少FITC。
PE单标，调节FITC减去多少PE。
APC单标，调节APC-CY7减去多少APC。
APC-CY7单标，调节APC减去多少APC-CY7.
所谓单标，就是拿4个流式管，往里面按标准用量各加一个抗体，然后每管里面再加入100ul标本，按正常步骤孵育、裂解、上机。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-2-22 12:54

                               
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抗体用量就按照说明书好了，标准用量，就是说本来你标本是用4个抗体一起染的，现在减掉一个，去调节其它 ...

哦，那如果用的是BD的机器，FMO对照可以不用了，就只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调就可以了是吗

willow2013

还想问您个问题，我之前定BD直标抗体的时候，没有定购同型对照，这样检测还有意义吗？有没有什么方法能补救下

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:00

                               
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哦，那如果用的是BD的机器，FMO对照可以不用了，就只用FITC单标、PE单标、APC单标、APC-CY7单标来调就可 ...

从原理上来说，这几管单标也可以算是FMO，只不过因为前两个和后两个之间不需要调节补偿，就分开来设FMO。

你用BD的机器的话，4个单标就行了。

niwanmao

willow2013 发表于 2013-2-22 13:03

                               
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还想问您个问题，我之前定BD直标抗体的时候，没有定购同型对照，这样检测还有意义吗？有没有什么方法能补救 ...

FMO对照就比同型对照更有参考意义。

willow2013

niwanmao 发表于 2013-2-22 13:07

                               
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FMO对照就比同型对照更有参考意义。

哦，我看有的文献做三色标记的时候，没有FMO对照，只用了IG1-FITC，IG1-PE，IG1-APC，IG1-APC-Cy7的同型对照了，这样也可以吗

willow2013

如果我只用了FITC-A单抗，PE-B单抗，没有同型对照IG1-FITC，IG1-PE的话，可以吗