Th17样本对照

anqun1988 · 发表于 2013-4-21 11:05:57

我现在在做Th17淋巴亚群，我现在是CD4和IL-17都做阴性对照，我现在的问题是如果按IL-17的阴性对照的话，我的样本管的图就会出现下面的情况，如果是抗体质量的问题，我用了流式老师那边的抗体也还是这样，如果群分的开的话，是不是不做对照也可以呢？

niwanmao · 发表于 2013-4-21 11:56:59

IL-17如果质量没问题，会分开，但由于比例很低，所以建议还是使用FMO对照来调节MARKER位置。
看了你的图，我有几个疑问：
1、两幅图中的两个标本是不是经过同样的刺激？
2、两幅图中的两个标本染色步骤是否一样，是否都经过固定、破膜等步骤？
3、第一幅图的同型与IL-17 PE 亚型是否相同？

anqun1988 · 发表于 2013-4-21 18:45:34

好的，谢谢您，是这样的
1、两幅图中的两个标本是经过同样的刺激的，条件都是一样的
2、两幅图中的两个标本染色步骤是一样的，都经过固定、破膜等步骤的，
3、至于第一幅图的同型与IL-17 PE 亚型是否相同的问题，我想问下那个PE同型还分好几种吗，我用的是IL-17 PE 的抗体，同型是试剂公司配给我的PE的同型对照
另外我想问下老师，那个IL-17一定要有同型对照吗
麻烦您了

anqun1988 · 发表于 2013-4-21 18:52:19

我用的都是BD的抗体及对照，老师，请问您们那边做Th17是用那种同型及对照呢，谢谢您了

niwanmao · 发表于 2013-4-21 18:58:14

anqun1988 发表于 2013-4-21 18:45

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好的，谢谢您，是这样的
1、两幅图中的两个标本是经过同样的刺激的，条件都是一样的
2、两幅图中的两个标本 ...

如果标本和处理方式均相同，那么可能问题就出在同型对照上，可能这个同型对照的非特异性染色过于明显。
建议看一下IL-17的说明书，看看其亚型是什么，如果确实亚型是Mouse IgG1来源的，那么建议尝试一下FMO，就是说如果你所有的标记是CD4 FITC/IL-17 PE/CD8 PERCP，那么对应IL-17的FMO对照就是CD4 FITC/CD8 PERCP，看看这个FMO对照的PE通道荧光如何。

anqun1988 · 发表于 2013-4-21 22:57:39

谢谢您，老师，我现在的标记是CD4 FITC/IL-17 PE，那么对应IL-17的FMO对照是不是CD4 FITC，看看这个FMO对照的PE通道荧光如何，又或者我换个同型对照试试？

niwanmao · 发表于 2013-4-21 23:17:48

anqun1988 发表于 2013-04-21 22:57:39

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谢谢您，老师，我现在的标记是CD4 FITC/IL-17 PE，那么对应IL-17的FMO对照是不是CD4 FITC，看看这个FMO对照

是的，用cd4单标的fmo看看pe通道荧光。

anqun1988 · 发表于 2013-4-21 23:37:54

嗯，好的，老师，我试试，另外，我想问下老师我有必要换种同型对照试试呢

winterking · 发表于 2013-4-24 07:57:09

胞内染色有时非特意性的确会比较高，个别同型对照就会有这样的表现，我觉得可以用FcR阻断抗体封闭一下试试

niwanmao · 发表于 2013-4-24 08:46:15

anqun1988 发表于 2013-4-21 23:37

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嗯，好的，老师，我试试，另外，我想问下老师我有必要换种同型对照试试呢 ...

同型对照需要同家公司并且同一个亚型的最好。
至于@winterking 站友所说的FcR阻断，确实也需要考虑一下。

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