抗体孵育时间及温度对结果的影响

刘星宇

检测胞膜受体表达情况：
试剂说明书推荐2~8℃孵育30~45min，折中取4℃中避光孵育40min，当时用BD canto Ⅱ检测，阳性百分比大约百分之十几，至少很少超出30%；
后来在工程师建议下，改为在室温（24~26℃）孵育40min，先用beckman XL 检测，再用FACSCalibur 检测，阳性率达到了40%~60%，孵育抗体前的标本没有大变化。

请教老师们：
1、这样的温度变化对结果会影响大吗？
2、室温下孵育时间过长是否会造成假阳性？

niwanmao

温度和孵育时间都是抗体染色优化过程中的一个变量，如果分群不清或染色效果欠佳时，确实需要优化。

didi_zhou

室温，20-30分钟应该差不多了。你可以做个时效嘛。

刘星宇

didi_zhou 发表于 2013-9-11 13:34

                               
登录/注册后可看大图

室温，20-30分钟应该差不多了。你可以做个时效嘛。

嗯，昨晚倪老师也说了4℃孵育30min，与室温孵育15min的效果基本等同。

pushiming77

我觉得还是按Kit上来吧，我一般孵育是4℃、30min，没有出现什么问题。在磁珠分选的时候，我用过过长的时间孵育抗体，导致比较多的非特异接合，想必流式的抗体染色也是一样；还是常温下染色对细胞本来就伤害比较大，这样会造成更多的死细胞，细胞的自发萤火要强于活细胞，这也就增殖阳性率。
生产厂家的Kit说明都是经过很多实验得来的最佳方案，我们一般不以更改。

niwanmao

pushiming77 发表于 2013-9-12 16:41

                               
登录/注册后可看大图

我觉得还是按Kit上来吧，我一般孵育是4℃、30min，没有出现什么问题。在磁珠分选的时候，我用过过长的时间 ...

“生产厂家的Kit说明都是经过很多实验得来的最佳方案，我们一般不以更改。”这句话我得纠正一下，那些抗体说明书中的只是一般是适合的，在一些情况下，对于不同的细胞，不同的环境还是需要进行优化。

刘星宇

niwanmao 发表于 2013-9-12 19:37

                               
登录/注册后可看大图

“生产厂家的Kit说明都是经过很多实验得来的最佳方案，我们一般不以更改。”这句话我得纠正一下，那些抗 ...

倪老师，那如果按照说明书推荐的4℃孵育30~45min，跟室温孵育的有差别，我该选择哪一个？我现在也怀疑是孵育温度升高、时间长造成了高假阳性率，但有一次有事耽误了裂解红细胞，孵育了一个半小时，百分比却是下降的。看到一些操作流程说最好整个处理流程都在低温环境（孵育抗体、裂解红细胞、洗涤、离心），但我看很多临床标本都是在室温下处理的。

刘星宇

pushiming77 发表于 2013-9-12 16:41

                               
登录/注册后可看大图

我觉得还是按Kit上来吧，我一般孵育是4℃、30min，没有出现什么问题。在磁珠分选的时候，我用过过长的时间 ...

“还有常温下染色对细胞本来就伤害比较大，这样会造成更多的死细胞”。
但很多临床标本都是在常温下处理的啊？
这实验真做到吐血。我们后面再比较下温度的影响，也看看时效的关系吧。原来我还在PBS中加1%BSA和0.1叠氮化钠，最后有老师说增加污染的机会，说没有必要，而说明书是推荐加BSA的啊。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-09-13 11:32:07

                               
登录/注册后可看大图

倪老师，那如果按照说明书推荐的4℃孵育30~45min，跟室温孵育的有差别，我该选择哪一个？我现在也怀疑是

我一直用的都是常温，没有试过四度。但是我认为应该相差不大，如果不敢确定你可以先对比测试一下。

niwanmao

刘星宇 发表于 2013-09-13 11:40:06

                               
登录/注册后可看大图

“还有常温下染色对细胞本来就伤害比较大，这样会造成更多的死细胞”。
但很多临床标本都是在常温下处理

常温染色对细胞伤害大，我觉得这句话纯粹只是属于理论上的推导，实际操作中我并没有碰到这种情况。