胞内染色问题

mimikiity

做过好几次，为什么胞内的蛋白总是染不出来呢，老师帮忙指点指点。
我的方法如下：
1,收集细胞，加anti-mouse CD4，CD25抗体，轻柔混匀，4℃避光孵育20min.
2,staining buffer 洗两遍，弃上清，每个样本加入100μl Fixation/permeabilization 试剂，室温孵育20min或4℃孵育过夜。
3,直接加入2ml perm buffer洗两遍，弃上清。
4,加入胞内抗体IL-17，FoxP3（抗体按一定量直接加入残余液中） ,室温避光20min。
5，直接加入2ml perm buffer洗两遍，弃上清，500μl staining buffer 重悬，上机。

dragonhzqsmmu

细胞内因子检测需要加入离子霉素刺激，另外还要高尔基体抑制剂防治刺激出来的因子分泌出去，你这个好像没有加啊

Foxp3你用的是哪家的抗体？感觉没染出来啊，呼唤管理员大大解决问题

niwanmao

看结果，确实都没染出来。
我的建议是：
1、不知道你使用的是什么破膜剂？foxP3是细胞核内的，而IL-17是胞内的，所以两者的破膜剂是不一样的，强烈建议使用不同的破膜剂，并且分开来做。
2、做的步骤建议参考说明书。如果按照一般的做法，你这里第4步加入胞内抗体时，应该是同时还加入100ul Perm液一起孵育才对啊。

mimikiity

niwanmao 发表于 2013-11-7 14:16

                               
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看结果，确实都没染出来。
我的建议是：
1、不知道你使用的是什么破膜剂？foxP3是细胞核内的，而IL-17是胞 ...

我两个是用的同一种破膜剂，都是染胞内的破膜剂。我再查查资料，谢谢老师

mimikiity

dragonhzqsmmu 发表于 2013-11-7 13:12

                               
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细胞内因子检测需要加入离子霉素刺激，另外还要高尔基体抑制剂防治刺激出来的因子分泌出去，你这个好像没有 ...

加了的，在收集细胞5h之前加了ebioscience的Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) 。

niwanmao

mimikiity 发表于 2013-11-11 11:13

                               
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我两个是用的同一种破膜剂，都是染胞内的破膜剂。我再查查资料，谢谢老师 ...

IL-17是胞内，但foxP3是核内的，不能使用同一种破膜剂。必须分开做。

liliqianyi

niwanmao 发表于 2013-11-11 12:43

                               
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IL-17是胞内，但foxP3是核内的，不能使用同一种破膜剂。必须分开做。

李老师，求科普。
我用的ebioscience的regulatory T cell staining kit， 其中检测FOXP3表达，破膜就是Fixation/Permeabilization solution和后面Permeabilization buffer，
是如何鉴别胞核和胞内的破膜剂呢

niwanmao

liliqianyi 发表于 2013-11-12 11:44

                               
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李老师，求科普。
我用的ebioscience的regulatory T cell staining kit， 其中检测FOXP3表达，破膜就是Fi ...

如果是foxP3配套的破膜剂，那么就是破核膜的。
是适合胞内还是核内的，每种破膜剂都有说明的，如果你不清楚，可以问代理商。

PS：鄙人姓倪，不是李

liliqianyi

niwanmao 发表于 2013-11-12 12:50

                               
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如果是foxP3配套的破膜剂，那么就是破核膜的。
是适合胞内还是核内的，每种破膜剂都有说明的，如果你不清 ...

呵呵，不好意思，n和l没太分清。
谢谢您的回复。
倪老师，有一些流式分选的问题向您咨询。
准备做小鼠treg的流式分选，想问ebioscience的抗体，说明书上提到一管1*10^6cells，加0.125ugCD4、0.06ugCD25，那我准备用1*10^8样品细胞，加多少量的抗体呢？
准备做个浓度梯度，只是从多少倍开始摸比较好呢？

niwanmao

liliqianyi 发表于 2013-11-12 16:37

                               
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呵呵，不好意思，n和l没太分清。
谢谢您的回复。
倪老师，有一些流式分选的问题向您咨询。

分选我倒没做过，在平时我们做免疫分型的经验，一般增加两个数量级的话，而染色体积不变（100ul），此时，抗体量一般用原量的2倍－4倍就差不多了。
当然也得看抗体本身的效价，你可以从1倍（即原量）、2倍开始摸索。