BD-FACS Calibur同时检测EGFP和mCherry时候通道的筛选

simnprince

对于流式还比较菜，学了下我们实验室的DB Facs Calibur的的说明书，说是BD Calibur的FL1,FL2,FL3的激发波长都是488nm的激光束，只是检测波长不同（依次绿、黄、红）而已。

然后对于要用FL4通道，是在激发波长为635激发波长下检测红色荧光时候使用的。



然后问题来了，比如下图：


我要检测的细胞是携带有以上双荧光基因的转基因细胞，我需要检测同一细胞中此二者的水平。
但是这时候怎么选择通道呢?
问过人有，有人说激发波长相差太大，EGFP的峰值的488nm激发波长处mCherry几乎没有信号的样子，一起检测够呛；
也有人说，能用488，对于EGFP选择FL1检测绿光,mCherry选择FL3检测红光，但是可行么。
而且二者发射波长区域看上去有很大的重叠，不知道检测的时候好不好区分，如果做补偿的话，这么大的重叠区域有没有什么影响呢？

还望有高手给与点知道，初学者，轻点拍砖哈～～～

那

花生逗

我们这边同时检测EGFP和mCherry用的是BD LSRFortessa，分别用488和561激光激发，效果很好。488激发mCherry效率很低，最好换成配备有561激光器的机器试试。

niwanmao

mCherry染料我没做过，但根据资料它应该是594nm激发的（参见http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2224-1-1.html第10页）。然而Calibur只有488nm和633nm两个波长的激发光，所以应该是无法有效激发的：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-235-1-1.html。

也希望做过类似实验的站友一起来谈谈经验@gcz5340  

tianhuahuang

Mcherry，确实要用561的激光器才行哈

tianhuahuang

可参考文献Flow cytometry of fluorescent protein.