大鼠Th17/Treg流式检测

倪shunlan

各位老师好！新手想问几个问题，谢谢！
1、Th17细胞都是要刺激的产生的，那会不会刺激出来的Th17细胞占CD4+的比值都是一样的多的？还是会根据疾病的不同，刺激出来的细胞量也有不同的？
2、我看到需PMA、离子霉素、莫能霉素刺激Th17细胞，请问需要三种一起刺激吗？还是可以选其中一或两种？
3、Th17细胞需要刺激，也就是说明我要分开测Th17、Treg细胞的，那么大鼠需要多少外周血量？（大鼠和人的血细胞压积相近吗？）
4、同型对照的问题：我看了倪老师之前一个回帖说“CD4+CD25+Foxp3+细胞不需同型，只需要再加一个CD45，有助于设门”是这样子的吗？还是要针对不同的实验有所不同？还有IL-17A抗体需要同型对照吗？

niwanmao

1、Th17不刺激当然也会有，但非常微量，太难测，所以还是需要刺激，至于刺激出的量，肯定不同的。
2、PMA和离子霉素是刺激，莫能霉素是阻断剂，按顺序使用：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-716-1-1.html
3、可以分开，最好分开，具体方案参见上面的链接。
4、对于这类低表达的指标，建议用FMO对照，例如你用CD4+CD25+Foxp3测Treg，那么用CD4、CD25作为FMO对照，同样IL17A也一样设置。

倪shunlan

niwanmao 发表于 2014-7-29 09:06
1、Th17不刺激当然也会有，但非常微量，太难测，所以还是需要刺激，至于刺激出的量，肯定不同的。
2、PMA和 ...

倪老师，请问PMA是佛波酯，还是丙二醇甲醚醋酸酯？应该是佛波酯，对吗？
佛波酯也称十四烷酰佛波醇乙酸酯，TPA或PMA是。T淋巴细胞激活剂、皮肤粘膜潜在致癌剂。应用：用于体外刺激T淋巴细胞增殖。经TPA刺激后，某些细胞转录因子，或膜表面分子表达增加。
{:soso_e100:}谢谢！

倪shunlan

老师，大鼠的细胞内因子也是由PMA和离子霉素刺激，莫能霉素阻断的，是吗？
谢谢！

niwanmao

倪shunlan 发表于 2014-8-1 10:05
老师，大鼠的细胞内因子也是由PMA和离子霉素刺激，莫能霉素阻断的，是吗？
谢谢！ ...

可以参考BD网站上的相关protocol，该Protocol是检测IL-4和IL-10的，但应该还是适用IL-17的：IL-4+ and IL-10+ rat cells:
Purified splenic CD4+ cells from an adult rat are stimulated with plate-bound anti-rat CD3 (clone G4.18, 25 µg/ml;  ) and soluble anti-rat CD28 (clone JJ319, 2 µg/ml;  ) for 2 days in culture together with recombinant rat IL-2 (10 ng/ml;  ) and rrIL-4 (50 ng/ml;  ), followed by a 3 day incubation with only rrIL-2 and rrIL-4. This is followed by a 4-6 hr stimulation with PMA (5 ng/ml; Sigma,) and ionomycin (500 ng/ml; Sigma) in the presence of a protein transport inhibitor. Alternatively, can restimulate with plate-bound anti-rat CD3 and soluble anti-rat CD28 for 4-6 hr in the presence of a protein transport inhibitor (either GolgiStop , or GolgiPlug ).


来源：http://www.bdbiosciences.com/res ... s/cytokines_fca.jsp

wuyan204

倪shunlan 发表于 2014-8-1 09:59
倪老师，请问PMA是佛波酯，还是丙二醇甲醚醋酸酯？应该是佛波酯，对吗？
佛波酯也称十四烷酰佛波醇乙酸酯 ...

PMA是佛波酯

倪shunlan

wuyan204 发表于 2014-8-5 16:33
PMA是佛波酯

谢谢你了！请问师兄（或师姐）你是做哪个细胞因子的的流式的？是做大鼠的吗？PMA、离子霉素、莫能霉素是多少量的？求指教。谢谢！

wuyan204

倪shunlan 发表于 2014-8-8 14:14
谢谢你了！请问师兄（或师姐）你是做哪个细胞因子的的流式的？是做大鼠的吗？PMA、离子霉素、莫能霉素是 ...

我做的是小鼠脾细胞，PMA终浓度0.025μg/ml,离子霉素终浓度1μg/ml。阻断剂买的是BD固定破膜试剂盒里自带的，BD555028,按照说明书里的参考用量。

以梦为x马

我做Treg，标记有CD4、CD25、Foxp3。     
对照能否加CD4，CD25同型对照，Foxp3就不加了，这样可以吗

niwanmao

以梦为x马 发表于 2015-1-25 09:07
我做Treg，标记有CD4、CD25、Foxp3。     
对照能否加CD4，CD25同型对照，Foxp3就不加了，这样可以吗 ...

1管CD4、FoxP3
1管CD4、CD25
不用同型。