查看: 2790|回复: 1
收起左侧

细胞超声裂解后用流式细胞术定量检测自噬

[复制链接]
发表于 2014-8-14 21:41:35 | 显示全部楼层 |阅读模式

亲爱的FLOWER,加入流式中文网,一起讨论,一起学习,享受更多福利吧!

您需要 登录 才可以下载或查看,没有帐号?加入流式中文网

x
自噬是一种细胞蛋白和细胞器在溶酶体中降解的动态过程。目前检测自噬的方法包括显微镜下计数细胞内自噬囊泡(AVS)的数量。
在本文中,作者发明了一种叫OFACS(细胞超声处理后的细胞器流式检测)方法,使细胞经过快速超声裂解后,形成均匀的细胞匀浆,但自噬囊泡仍能保持其荧光标记(经光镜、电镜鉴定AV囊泡保持完整)。
具体步骤如下:
  • 细胞用含10%FBS的RPMI-1640培养,并经药物处理,加入AO染料。
  • 细胞用3×1s的频率进行超声裂解,湿度75%。也可以用28 G 1/2的胰岛素针头反复抽吸细胞,可产生类似的效果,不过超声裂解更简单、更可靠、重复性更好。
  • 细胞匀浆在室温或4℃下上机。


分析时,首先通过FSC/SSC圈出亚细胞群体(见图1),然后特异的自噬囊泡可通过特定的荧光通道圈出(图2),并与对应的细胞数量、微球进行校准计数。

图1

图1


图1

图2

图2


图2


该方法已在以下细胞株中验证通过: PC3, LNCaP, HEK293, U87, MEF, 537MEL, BT474, SKBR3, ZR-75, MCF7, SKMEL23, MALME3, MALME3M and HME (American Type Culture Collection).



PLoS One. 2014 Jan 29;9(1):e87707.
Novel quantitative autophagy analysis by organelle flow cytometry after cell sonication.

Degtyarev M(1), Reichelt M(2), Lin K(1).

Author information:
(1)Department of Translational Oncology, Genentech, South San Francisco, California, United States of America.
(2)Department of Pathology, Genentech, South San Francisco, California, United States of America.

全文:http://www.plosone.org/article/i ... ournal.pone.0087707

组织样本处理不好?流式中文网原研的魔滤®魔杵®套装,低成本解决,高质量收获
您需要登录后才可以回帖 登录 | 加入流式中文网

本版积分规则 需要先绑定手机号

关闭

本站推荐上一条 /1 下一条

手机版|流式中文网 ( 浙ICP备17054466号-2 )

浙公网安备 33038202004217号

GMT+8, 2021-11-29 10:39

Powered by Discuz! X3.4

© 2001-2013 Comsenz Inc.