改善流式细胞术检测免疫表型报告方式的策略

niwanmao

流式细胞术现在已经成了分析免疫系统功能的基础工具。多色流式细胞术更是极大地扩大了免疫表型分析的应用范围。然而，除了正确选择对照以及方法学之外，标本的制备方法、数据的分析方法，也可影响结果，甚至会导致结果误读。

（一）标本制备方法
目前实验室大多利用密度梯度离心法制备标本，并且经常会将这些标本冻存起来。这种步骤虽然规避了全血样本的保存，但却会丢失50％以上的白细胞（主要是嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞和中性粒细胞）,并且分离步骤的准确性及其分离得到的纯度不能保证，最重要的是，密度梯度离心获得的标本无法做到对原样本的准确计数。

因此，在临床实验室中，更多的是用全血样本，并且有大量数据表明，利用单平台法进行绝对计数可有效减少实验室之间的差异，例如HIV患者的CD4＋细胞绝对计数，不仅可有效判断HIV病人治疗效果，而且单平台法可将实验室间误差减少约5％。还有CD34＋干祖细胞绝对计数，采用单平台法（ISHAGE）可使36个实验室之间的CV值减少约10％。

（二）数据分析方法
目前分析免疫细胞最常见的方法就是用百分比，例如计算调节T细胞（CD4＋CD25＋CD127low）占CD4＋细胞的比例，根据这种比例变化，然后总结出结论。这种百分比的比较方式，是建立在父级细胞群数量不变的基础上的，但实际上，如果前述的Treg占CD4＋细胞的比例发生增高，是由于Treg细胞增多引起的，还是CD4＋细胞减少造成的呢？

因此，Michael P Gustafson在《Strategies for improving the reporting of human immunophenotypes by flow cytometry》（Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2014, 2:18）一文中指出，建议采用未经处理的样本（如全血）、利用绝对计数方法报告免疫细胞分析结果，可提供流式数据的准确性，并且能够更直接、客观、真实地反映出研究结果。

图1

Figure 1 数据表示方式和标本制备方法可能影响免疫细胞分析结果。
A—— 27例胶质母细胞瘤患者（GBM）和40例健康人对照（HV）的T细胞、B细胞和淋巴细胞均以百分比表示（第一行）或绝对计数表示（第二行），可看到T细胞和B细胞在百分比上都有统计学差异，但实际上，如果看到绝对数，就会发现，T细胞确实存在差异，但B细胞的差异是由于淋巴细胞绝对数减少引起的，其绝对值原本是没有差异的。
B—— GBM患者初发（n=13）、治疗（n=12）、HV对照中NK细胞用占淋巴细胞比例（左侧图）、NK细胞用绝对数表示（中间图）、淋巴细胞绝对数（右侧图） ，NK细胞的百分比没有统计学差异，但如果用绝对数，就可以发现NK细胞和淋巴细胞均存在统计学差异，正是由于NK细胞和淋巴细胞绝对数发生同步减少，所以其百分比无法出现差异。

文献全文在线免费阅读：https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NjgwOHxhNTc2MWQ4ZnwxNzEzNTY1NTU0fDB8
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2014-10-21 19:17 上传

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fdluzhufeng

那么能否请教下倪老师,从获得全血标本，到标记抗体，到上机，中间的具体步骤怎么操作呢？和以往的密度梯度离心有无重要的处理方面的不同之处？

niwanmao

fdluzhufeng 发表于 2015-11-23 05:57
那么能否请教下倪老师,从获得全血标本，到标记抗体，到上机，中间的具体步骤怎么操作呢？和以往的密度梯度 ...

这个话题太大了。大部分内容我在站内其实以前都发过，你可以慢慢看过去。
裂解法比密度梯度离心法的优点就是：速度快、避免丢失珍稀细胞。