CD107分子检测T细胞杀伤功能

gaga1989xl

大家好，我最近在做CD107分子检测T细胞杀伤功能,用培养后的PBMC或CD3+细胞对K562细胞进行杀伤，如果效应细胞（NKT或者CD8+T）能够对肿瘤靶细胞杀伤,则会分泌CD107(溶酶体相关膜蛋白）从而释放穿孔素，颗粒酶对靶细胞进行杀伤，运用这一特点，我们可以分析培养后的T细胞哪些是可以活化进行肿瘤细胞杀伤的。具体的方法参见文献，简单来讲就是把效应细胞和肿瘤细胞共孵育后加入莫能菌素之类的蛋白转运抑制剂（主要是抑制CD107分子的内吞），同时将要标记的CD107和CD8等抗体加入共孵育后上流式进行检测。我自己做这个实验时发现我要进行攻击靶细胞K562单独检测100%的显示CD107阳性，这样一来，严重干扰了实验结果，所以结果都不能 用了。由于CD107分CD107a和CD107b两个亚型，前面的实验我是将CD107a-PE和CD107b-PE同时标记的，猜想是不是由于a和b发生反应导致了假阳性，于是分别用CD107a，CD107b单独标记K562，上流式分析发现两种单标CD107都几乎是阴性的，于是很高兴的认为找到了原因，再次做上述的杀伤实验，由于文献报道T细胞进行杀伤时主要分泌CD107a，因此这次我选择了用CD107a单独标记，很令我经验的是这次的K562细胞仍然是100%阳性，想请教各位战友，这到底问题出在哪里？文献报道的CD107实验也不乏用K562细胞作为靶细胞的（NK细胞能够特异识别和杀伤K562），同时也没有文献报道肿瘤细胞膜表面会表达CD107，一般是jurkat之类的细胞会在胞浆表达。
附件是该类实验的一些参考文献和我的流式结果，希望大家帮忙分析，感激不尽！{:soso_e154:}
压缩包内6个流式文件
1.K562标记CD107a-PE，CD3-APC，CD8-PercP
2.培养后T细胞未加K562细胞标记CD107,CD3,CD8，荧光同上，该样主要想检测T细胞本地自发放CD107
3.培养后T细胞加PHA刺激，标记CD107,CD3,CD8,荧光同上，该样主要是作为阳性对照，圈出活化表达CD107的T细胞门
4.培养后T细胞加K562细胞（5：1比例）想分析T细胞表达CD107比例，奈何K562竟然全阳性。
5.K562单独标记CD107a
6.K562单独标记CD107b
PS: 文献里CD107是要与混合细胞37度，5%CO2培养箱里共孵育30min或者5h的，我选择的是孵育30min，而文件5和6里K562单独标记CD107a或CD107b选择的是4度标记30min，检测结果就基本是阴性的，这个有影响吗？

Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells：
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzI5OXwyYjc0YmMyOHwxNzQ3MTM1MTk5fDB8


基于CD107a标记流式细胞仪检测NK细胞毒性方法的建立:
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzI5OHwyMmU2MmViOHwxNzQ3MTM1MTk5fDB8


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2014-12-30 15:43 上传

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niwanmao

单纯看K562细胞，确实CD107a是有弱表达的，见下：

空白


CD107b


CD107a



但这个应该不是你关注的重点，你应该关注的是Tc细胞内的CD107表达，所以，建议你分析的时候应该只选择Tc细胞分析即可：

gaga1989xl

niwanmao 发表于 2014-12-30 21:09
单纯看K562细胞，确实CD107a是有弱表达的，见下：

空白

倪老师，谢谢您的热心回答，我想请教如何才能圈出正在的淋巴细胞呢？您看一下附件1的结果，是K562细胞与实验组进行相同操作和标记后的结果，K562的位置很弥散，在淋巴细胞门的地方也有分布，而且分析其CD3CD8也出现了部分阳性，CD107更是100%阳性，真的很奇怪。如果我圈出的淋巴细胞门内有K562细胞，那其100%的阳性对结果影响很大。这个实验我已经重复3次了。如果K562真的是假阳性，那可能的原因有哪些呢？我用293T细胞标记CD107a，CD107b和CD107a+b，得到的阳性率分别是60%，0%和84%，结果同样匪夷所思!
再次感谢您的回答！

yuemin5

你可以试试用PKH-67染色K562，然后再混合CTL细胞做杀伤检测。这样你可以把两种细胞分得很开。
PKH-67是一种绿色荧光染料，用于活细胞染料。PKH-67能与细胞膜的脂质区结合，使其染色。配合用碘化丙啶或氨基放线菌D，可用于细胞毒性试验；根据PKH67染料的稀释率, 也可用增殖检测（或扩散检测），用于证明细胞膜转移，吞噬作用，抗原呈递及活体细胞交换的研究。

下面是我做的一个比例染色的结果，希望能帮到你。

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2014-12-31 00:45
倪老师，谢谢您的热心回答，我想请教如何才能圈出正在的淋巴细胞呢？您看一下附件1的结果，是K562细胞与 ...

K562细胞颗粒大，而且培养的细胞株非特异性荧光很高，所以不能跟Tc细胞用同样的门区分阴阳性。

你不是说检测Tc细胞的杀伤能力吗？为什么要把K562细胞圈进去呢？我有点不太理解。

此外，@yuemin5 站友提供的方法也是一个选择。

gaga1989xl

niwanmao 发表于 2014-12-31 10:00
K562细胞颗粒大，而且培养的细胞株非特异性荧光很高，所以不能跟Tc细胞用同样的门区分阴阳性。

你不是说 ...

是的，我的目的就只是分析T细胞，不希望有K562的干扰，但是在T细胞门内会存在一些较小的K562，而K562的CD107表达几乎100%，所以即使T细胞门内只有少量K562，仍对结果干扰非常很大，因此很苦恼……楼上战友的方法可以试一试。谢谢您的回答。

gaga1989xl

yuemin5 发表于 2014-12-31 08:56
你可以试试用PKH-67染色K562，然后再混合CTL细胞做杀伤检测。这样你可以把两种细胞分得很开。
PKH-67是一种 ...

谢谢您的建议，因为也是实验需要，初涉流式分析，很多知识还需要学习，请问您有做类似的实验吗？能否分享一些经验？您说的这种染料能否用Calcein-AM（钙绿荧光素）代替？这是一种细胞核结合的染料，用来做普通的细胞杀伤实验，同样也是发绿光的。

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2014-12-31 13:36
是的，我的目的就只是分析T细胞，不希望有K562的干扰，但是在T细胞门内会存在一些较小的K562，而K562的CD ...

我上面那个回帖中第三个图就是排除了K562细胞给你看的，原来你还没有理解我昨晚发的这几个图？
那几个门就是排除了K562的淋巴细胞群，K562和淋巴细胞大小相差很大，通过FSC和CD3、CD8马上就彻彻底底把两者分开了，懂了没有？

gaga1989xl

倪老师，我明白您的意思，我只是不确定这样能否把K562彻底排除干净，因为单看K562的流式图，CD3，CD8通道K562自发荧光那么高，而FSC又有一些是和淋巴细胞处于同一范围的，那如果处于淋巴细胞FSC范围内的K562细胞又刚好CD3，CD8自发荧光很高，就还是不好去彻底排除。不知道我的理解是不是有偏差？
祝您新年快乐，祝流式中文网新的一年更上一层楼！{:soso_e112:}{:soso_e179:}

niwanmao

gaga1989xl 发表于 2015-1-1 10:06
倪老师，我明白您的意思，我只是不确定这样能否把K562彻底排除干净，因为单看K562的流式图，CD3，CD8通道K5 ...

你可以仔细看看上面的图，排除的一干二净，自发荧光和阳性完全不在一个道上，并且FSC已经分开得差不多了。通过FSC/SSC和CD3/CD8之后如果还有K562混在里面，你来找我算账。