小鼠骨髓B细胞流式

十二郎

各位战友好，最近在做小鼠骨髓B细胞的流式过程中，遇到一些问题，请指教。1、三种单标的阴阳性标记很不稳定，以ISOtype来判断阴阳性的时候，有时候没有阳性没有阴性，有时候却全是阳性没有阴性群。
2、CD43有时候在单标管中没有阴阳性分群，但是在3色标记中却阴阳性很明显。附上个人的流式protocal，还望各位指教，谢谢。
本人以前做出来过很明显的阴阳性分群，区别如下：1、以前是用1%草酸铵冰上裂解3分钟裂解红细胞，现在是用商业化的联科生物的裂解液。2、以前在孵育IgM之前并没有洗涤两次，后来听说IgM易于血清中抗体结合，所以要洗涤3次。
望高人指点。

小鼠骨髓淋巴细胞流式步骤：

抗体为ebioscience公司，stain buffer为BD公司。

1、        小鼠断颈处死。

2、        1毫升注射器冲出双侧股骨细胞于EP管中，EP管中事先加入1毫升stain buffer。

3、        250g离心力、5min离心，弃去上清

4、        联科生物红细胞裂解液储液1:10稀释成工作液，加入2毫升工作液裂解红细胞，同时200目滤网转移至4毫升离心管，2min后加入2毫升stain buffer终止裂解，5分钟250g离心。

5、        再次2毫升stain buffer重悬，5分钟250g离心，洗涤两次。

6、        1毫升重悬，100微升分装至各离心管中，依次为blank、B220-percpcy5.5单标、CD43-fitc单标、IgM-PE单标、三色标记。

7、        避光，4度孵育30分钟。

8、        5分钟250g离心，stain buffer洗涤两次。

9、        上机检测。

niwanmao

1、确保同型对照与抗体属于同亚型、同物种、同浓度，前两个条件可能大家都看的到，但同浓度可能很多人不会注意，导致最后设门成问题。
2、CD43单标和三色的分群不同，请注意排除补偿影响或加的抗体量不同这两个原因可能性。
3、草酸铵裂解似乎在流式上还没看到过，不知道你以前是从哪里看到这个配方的？
4、IgM是必须要洗涤后染色的，这没有错。
5、染色步骤还是建议先染色再裂解，这是目前最标准的染色方法。

十二郎

niwanmao 发表于 2015-5-1 14:52
1、确保同型对照与抗体属于同亚型、同物种、同浓度，前两个条件可能大家都看的到，但同浓度可能很多人不会 ...

倪老师好，回答一下问题：
1、抗体同型对照这个不会有问题。
2、CD43单染管和三色标记的抗体量是一样的，单染管没有明显分群，三色标记没有进行补偿时，直接圈出淋巴门，CD43的直方图就会有明显分群，已经出现过两次这样的情况。
3、是氯化铵，打字成草酸铵是我的错误。
4、染色的话，要是先染色，后裂解。那么做骨髓和脾脏的话有没有protocal可以参考，能否给个链接之类的。谢谢

niwanmao

十二郎 发表于 2015-5-1 16:06
倪老师好，回答一下问题：
1、抗体同型对照这个不会有问题。
2、CD43单染管和三色标记的抗体量是一样的， ...

染色的步骤上，骨髓和脾脏没有区别。
氯化铵裂解液没有1％之说，只有10×储存液和1×工作液之分。

如果你以前做的没有问题，建议你用以前的方案，但是IgM必须要洗涤。

另外，如果仍有问题，建议把图或原始数据传上来，看图说话会更容易看出问题。

十二郎

niwanmao 发表于 2015-5-2 16:09
染色的步骤上，骨髓和脾脏没有区别。
氯化铵裂解液没有1％之说，只有10×储存液和1×工作液之分。

倪老师  换用氯化铵裂解液后  问题已解决

Arcrain

这是说说明联科的红细胞裂解液影响了结果？

ddn111

商品化裂解液要了解配方才能在标记前裂解，像BD的裂解液就含有固定成分，所以标准流程都是先标记后裂解！

十二郎

Arcrain 发表于 2015-5-6 11:47
这是说说明联科的红细胞裂解液影响了结果？

我也不知道裂解液到底有没有问题，就是换用氯化铵裂解液后冰上裂解2分钟，B220能有高低表达，IgM也能标记上了。不过我一般都是先裂红。然后洗三遍，再进行细胞计数，再孵抗体。要是不裂红的话，是先孵抗体，再裂红吗？有没有资料可供参考？？

十二郎

ddn111 发表于 2015-5-6 20:55
商品化裂解液要了解配方才能在标记前裂解，像BD的裂解液就含有固定成分，所以标准流程都是先标记后裂解！ ...

你好，我的流程是先裂红，洗三遍，再计数，然后孵抗体。我认为这样可以保证对照鼠与实验鼠每管的细胞数相差不大，在1-2X10的6次方之间，抗体浓度也是也一样的。就是保证相同数量的细胞有相同的孵育体系。我想请教一下，要是先孵育抗体的话，在抗体浓度一样时，怎样才能保证实验组与对照组的细胞数目一样呢？还望不吝赐教，有没有相关的比较成熟的protocal可以参考，谢谢。欢迎讨论

十二郎

十二郎 发表于 2015-5-7 09:00
我也不知道裂解液到底有没有问题，就是换用氯化铵裂解液后冰上裂解2分钟，B220能有高低表达，IgM也能标记 ...

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