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效应CD4+ T细胞以往被认为只是由Th1或Th2组成，现在认识到还有Th9、Th17和Th22。这些细胞的区别在于它们分泌的细胞因子：
- Th1细胞分泌IFN-γ；
- Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13；
- Th9细胞分泌IL-9；
- Th17细胞分泌IL-17；
- Th22分泌IL-22。
需要说明的是，以上因子并非这些细胞所有因子，而是其中几个最有特征性的。
分泌细胞因子的免疫细胞在适应性免疫中起着中心作用，对这些细胞进行定量，有助于理解免疫反应。Th1和/或Th17细胞在一些疾病发病过程中有着重要作用，例如炎症性肠病、类风湿性关节炎和多发性结节性硬化等。对Th1和Th17细胞的定量，可为这些疾病和其它Th1和/或Th17相关疾病的研究提供重要信息。
流式细胞术检测人外周血Th1、Th17细胞有两种主要方法，一种主要是根据细胞表面标记，如CXCR3、CCR6、CD161，比较节省时间，但这些标记不是Th1、Th17特异性的，故容易导致比例增多，另一种则根据表面和胞内染色，通过体外培养刺激，促进细胞分泌细胞因子。我们这里讲的就是第二种方式。
本节中的protocol主要步骤是将人PBMC（外周血单个核细胞）分离出，然后标记碘化丙啶（PI）和吖啶橙（AO），然后以PMA/离子霉素/布雷菲德菌素A刺激，接着标记CD3、CD4、CD8标记，最后标记胞内细胞因子，上机检测。
在流式中文网论坛上，经常会有站友问到PMA、离子霉素等的浓度，在此将protocol中的活化培养基配方单独提出来分享给各位FLOWER：
1、配制储存液
Brefeldin A, 5 mg/ml
将brefeldin A (Sigma)粉剂溶解于DMSO，配制成5 mg/ml储存液，分装成20μl一管，保存在-20℃可保存6个月。
Ionomycin, 0.5 mg/ml
将ionomycin (Sigma)粉剂用纯乙醇溶解，配制成0.5 mg/ml储存液，分装成20μl一管，保存在-20℃可保存6个月。
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), 0.1 mg/ml
将PMA (Sigma)粉剂溶解于DMSO，配制成0.1 mg/ml 储存液. 分装成20μl一管，保存在-20℃可保存6个月。
2、配制活化培养基
将PMA、ionomycin和brefeldin A各取出一管，在180μl培养基中加入20μl 0.1mg/ml PMA（就是前面分装的一管），配成PMA稀释液。
取一支15ml离心管，加入4ml X-VIVO 15培养基，再4μl PMA稀释液、8μl 0.5mg/ml离子霉素储存液、8μl 5mg/ml brefeldin A储存液。
这样，终浓度分别为：10 ng/ml PMA, 1 μ g/ml ionomycin, and 10 μ g/ml brefeldin A.
提取PBMC、计数PBMC、刺激、表面和胞内染色等详细步骤点击下面图标，即可免费在线阅读PDF，无需下载。
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=ODAwOXwyMmQ4MjEzNTc1YTVmZTllY2VmM2Y1Yzc4NTE0MDc1MHwxNjE4NzE0NzM3&request=yes&_f=.pdf
如需下载PDF，需1颗流星：
Quantification of Th1 and Th17 Cells with Intracellular Staining Following PMA I.pdf
(236.67 KB, 下载次数: 240, 售价: 1 流星)
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发表于 2015-5-12 20:01:07
发表于 2016-5-24 00:36:27
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