大鼠血液流式图

xiaosheng8866

大鼠流式图，为什么血液细胞分群不清楚，而且老师做出的图感觉不对。所用 仪器是BD  FACSCalibur 流式细胞仪，分析软件是CellQuest。
有的样本裂解后有血块，流式管底有絮状物，求高人解答！小弟在此谢过了！！！！

小憨

首先你样品状态不好，太多死细胞了，下次在样品处理时下点功夫。
第二你电压调的也不好，阴性群都没全出来

niwanmao

确实如@小憨 所说，两个关键性问题啊，标本处理和电压。

xiaosheng8866

谢谢各位的帮忙！

xiaosheng8866

小憨 发表于 2015-6-4 08:05
首先你样品状态不好，太多死细胞了，下次在样品处理时下点功夫。
第二你电压调的也不好，阴性群都没全出来 ...

请问如何处理细胞，可以避免少死细胞？
1，分别取100ul抗凝全血加入到流式试管中（注意血不要碰到管壁）。
2，在试管中依次加入稀释好的抗体各20ul，加完抗体后，涡旋混匀，室温避光30min。
3，配红细胞裂解液：将10 x溶血素与0.22um滤过的蒸馏水按1：9的比例稀释，充分混匀，配到所需要的体积。
4，抗体与血20min反应完全后，取出试管，各管加入10倍稀释溶血素2ml，涡旋混匀，室温避光反应8-10min（注意时间不宜过长，以免破坏白细胞），8到10分钟后将试管取出，此时，可看到管内液体澄清透亮。
5，把试管放入离心机（注意配平），以500 g离心力，室温离心5min，5min后取出所有试管，垂直倾倒上清液，涡旋混匀，每试管中加入2ml的PBS，涡旋混匀。
6，以500 g离心力，室温离心5min，5min后取出所有试管，垂直倾倒，弃去上清，并充分涡旋混匀各样本管。
7，在每个样本管加入0.5ml的,4﹪多聚甲醛的PBS，充分涡旋混匀。
8，将样本管置于4℃冰箱避光保存，24h后上机检查。
我前后上机共6个小时

niwanmao

xiaosheng8866 发表于 2015-6-4 13:25
请问如何处理细胞，可以避免少死细胞？
1，分别取100ul抗凝全血加入到流式试管中（注意血不要碰到管壁） ...

500g的离心力，不知道你的离心机半径多少，如果半径小的话，转速就很高了，请参照http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-207-1-1.html 换算一下，我们一般建议1500转/分。太高细胞容易死。

xiaosheng8866

niwanmao 发表于 2015-6-4 16:20
500g的离心力，不知道你的离心机半径多少，如果半径小的话，转速就很高了，请参照http://www.flowcyto.cn ...

非常感谢版主！！！

小憨

xiaosheng8866 发表于 2015-6-4 13:25
请问如何处理细胞，可以避免少死细胞？
1，分别取100ul抗凝全血加入到流式试管中（注意血不要碰到管壁） ...

我一般先裂解红细胞，再加入流式抗体。细胞重悬在最多100 μL PBS中，再加抗体

xiaosheng8866

小憨 发表于 2015-6-4 18:47
我一般先裂解红细胞，再加入流式抗体。细胞重悬在最多100 μL PBS中，再加抗体 ...

流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。请问这个可以代替pbs洗涤样本吗

xiaosheng8866

niwanmao 发表于 2015-6-4 16:20
500g的离心力，不知道你的离心机半径多少，如果半径小的话，转速就很高了，请参照http://www.flowcyto.cn ...

流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。请问这个可以代替pbs洗涤样本吗