使用串联染料的注意事项和诀窍

niwanmao

上周《串联染料真的毫无是处？就那么受人歧视吗？》（http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4518-1-1.html），澄清了大家对串联染料的一点误会。在帖子中，有FLOWER提出了，如何避免降解，如何检查发生了降解？
这确实是个问题，所以我们得认真回答一下。

有关串联染料的重要说明
1. 串联染料是利用FRET（能量转移）实现受体荧光分子的激发，但其效率不可能达到100％，所以会有一些供体荧光分子的渗漏。例如PE-cy7荧光分子，即使不降解，也可能会有少量PE荧光渗漏，不过一般情况下荧光分子质量好的话，可以忽略。但仍需时常记得用同型对照和串联染料单染标本调节补偿。
2. 串联染料容易发生所谓的“降解”，意味着受体荧光分子发光减弱或丢失，而供体荧光分子发光增加。因为串联染料是共价键连接的，所以供体荧光分子和受体荧光分子不会完全分离，之所以无法继续进行FRET，原因可能有两种：一是受到光照导致供体和受体荧光分子均发生淬灭，二是氧自由基破坏了受体荧光分子。无论哪种均可造成串联染料不可逆破坏。
3. 在多色流式中使用串联染料，切记要使用同型对照确定背景荧光，使用单染管调节补偿，使用FMO（Fluorescence minus one）对照设门。


正确使用串联染料的诀窍
1. 避光，并且避免温度过大波动（4℃避光）。
光会使荧光分子淬灭大家都很清楚，但是温度可能很多人不会去注意，切记不要将串联染料抗体冷冻。
2. 避免“过度固定”。
串联染料固定时间不要超过30分钟，及时进行洗涤重悬。
3. 需注意在多色流式时受体荧光分子被不同激发光激发的可能。
例如 PE-cy5串联染料中的受体荧光分子Cy5既可被蓝光先激发PE分子再通过FRET作用激发，也可被红光直接激发，所以在和APC染料合用时要注意，不过可以通过补偿调节排除。
4. 在4℃或冰上标记细胞。
APC串联染料稳定性偏差，容易受细胞代谢影响，所以利用低温降低细胞代谢可提高这类串联染料的稳定性。
注：本文译自Biolegend网站 http://www.biolegend.com/tandem_dyes

小憨

非常好的资料，学习了~

xiehou315

挺受用，在使用串联染料时就知道该如何处理了。

特勒兮兮

倪老师，有一个问题，关于FRET荧光共振能量转移的，PE-Cy7，和APC-Cy7，都是串联染料，APC的发射光谱大概在600-750，波峰在660位置，而Cy7的激发波峰在710，两个之间有重叠的，而且660也接近710了，可以能量转移及这个效率我能理解，但是PE-Cy7咋回事，发射光谱大概在525-725之间，虽然也有重叠，但是这个PE波峰在575的位置，离710也太远了。

niwanmao

特勒兮兮 发表于 2019-10-25 14:45
倪老师，有一个问题，关于FRET荧光共振能量转移的，PE-Cy7，和APC-Cy7，都是串联染料，APC的发射光谱大概在 ...

发生共振能量转移的其中机制，可以肯定的是不单纯是波长，还涉及到一定的距离引起的能量转移。这已经超出我们的能力范围了。