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实例告诉您,为什么抗体滴定这么重要?

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发表于 2015-8-19 19:56:42 | 显示全部楼层 |阅读模式

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在做流式的时候,可以说99%的FLOWER都是拿到抗体就找说明书,找到说明书就开始找用量,然后按照厂家给的用量直接开始做实验或临床检测,实验结果不佳,往往会首先怀疑抗体问题。此步骤可以说是非常正常、非常普遍的一个流程,也就是所谓的习惯成自然。

但是我们有没有考虑到按照说明书标准用量会导致不佳甚至不正确的结果呢?因为大家可能都忽略了说明书上标准用量后面的一句话:『 It is recommended that the reagent be titrated for optimal performance for each application.』

此时很多FLOWER可能会有疑问:
1、既然抗体作为商品出售,就应该制定标准用量,标准用量就应该保证实验结果,为啥还要我们来滴定呢?
因为厂家出厂的时候,可能针对第一批抗体制定了标准用量,但由于每一批抗体纯化、制备的时候浓度不可能保证完全一致,所以商品化的抗体每一批次最佳用量都可以会有所不同,因此抗体滴定确定最佳用量对于保证实验结果很重要。

2、我不滴定,直接用最佳用量真的会做不好结果吗?
还真的会。就拿我这几天的一个抗体HLA-DR BV421来说,前段时间做免疫分型的时候,按照标准用量,阳性结果能出来,但总感觉阳性峰荧光不强,并且阳性和阴性峰分得不开,与以前做4色免疫分型使用的APC荧光相差甚大。
于是不放心,昨天进行了一次滴定,这次滴定做的梯度不多,只设了3个,分别是1/4量(1.3ul)、半量(2.5ul)、全量(5ul),染色完之后计算染色指数『(阳性峰geomean-阴性峰geomean)/2*SD(阴性峰)』,结果如下:
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发表于 2017-2-23 21:43:51 | 显示全部楼层
想请问一下,一楼的例子滴定结果应该是1/4推荐用量能够能更好的区分阴性和阳性峰,在这两种抗体用量的流式图中,阴性峰的位置没有发生明显移动,但是推荐用量的阳性峰较1/4推荐用量的要偏左。我在实验中也遇到这个问题,当抗体用量增加时阳性峰明显左移,请问是什么原因造成的这个现象呢?
 楼主| 发表于 2015-8-20 11:04:40 | 显示全部楼层
水念人倦 发表于 2015-8-20 08:52
倪老师您好,我想请教这样一个问题。例如我做NK的时候,假设ISO滴定的量是5ul,CD3滴定的量是5ul,CD56滴定 ...

滴定肯定要各个抗体各自滴定的,不能在一起滴定。
至于你这里提到同型,这个不能滴定吧
发表于 2015-8-20 08:37:30 | 显示全部楼层
倪老师,我也发现了。推荐用量5ul其实太大了,只要1ul就非常好了。我滴定了八种抗体,5种是1ul,三种是0.25ul最佳,差距真大。5ul往往分群不好。
发表于 2015-8-20 08:52:31 | 显示全部楼层
倪老师您好,我想请教这样一个问题。例如我做NK的时候,假设ISO滴定的量是5ul,CD3滴定的量是5ul,CD56滴定的量是10ul,CD16滴定的量是5ul,当我实际检测的时候,SAMPLE管加3ulCD3+10ulCD56+5ulCD16就可以了么?他们相互会有影响么?在做多种标记的时候,是单独各自滴定还是一起滴定呢?
发表于 2015-8-21 08:23:45 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2015-8-20 11:04
滴定肯定要各个抗体各自滴定的,不能在一起滴定。
至于你这里提到同型,这个不能滴定吧 ...

我对ISO一直有些疑问。。之前做一些阴性样本的时候。ISO的峰比阴性样本的峰还要强,联系了BD的技术,他们说是效价的问题。。请问倪老师怎么确定ISO的最适浓度呢??
另外之前提到的,抗体各自滴定后,混起来时按照滴定的量加就可以了么?
发表于 2015-8-28 17:07:48 | 显示全部楼层
请问染色指数『(阳性峰geomean-阴性峰geomean)/2*SD(阴性峰)』中的SD是个什么参数?
 楼主| 发表于 2015-8-30 21:31:59 | 显示全部楼层
jingweis530 发表于 2015-8-28 17:07
请问染色指数『(阳性峰geomean-阴性峰geomean)/2*SD(阴性峰)』中的SD是个什么参数? ...

standard deviation,基本上flowjo、kaluza里面都有。
发表于 2015-8-31 16:13:05 | 显示全部楼层
若没有用flowjo、kaluza,怎么可以取得SD这个参数呢?抗体滴定真的很重要
发表于 2015-9-13 15:03:17 | 显示全部楼层
骨髓中,sca-1和c-kit这两个抗体连续表达,怎么滴定啊?另外flowjo中文手册里面是按照“阳性荧光中值/阴性荧光中值=MFI”,最后比较MFI大小,这个公式可以吗?
 楼主| 发表于 2015-9-13 20:34:56 | 显示全部楼层
decade911 发表于 2015-9-13 15:03
骨髓中,sca-1和c-kit这两个抗体连续表达,怎么滴定啊?另外flowjo中文手册里面是按照“阳性荧光中值/阴性 ...

sca-1和c-kit在你检测的细胞中可能呈连续表达,但在一些干祖细胞表面是可以分群很明显的。所以你可以采用那些细胞来滴定。

至于滴定的评价指标,一种就是你提到的flowjo手册里的信躁比,还有一种就是我在前面提到的染色指数,两者均可,但相对来说染色指数更好一些。
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