流式样品处理条件

大头

菜鸟问大家一个问题，流式样品处理能不能用90%甲醇-20度15分钟一次性固定打孔细，我是这么处理后用3%BSA封闭样品30分钟，然后计数每个样10^6个细胞加一抗孵育一个小时后，PBS洗两次后，加二抗孵育30分钟，PBS洗一次后上级检测，但每次细胞量都很少，极个别能收到10000个细胞，大部分就只能收到两三千个细胞，还有更少的只有几百个，然后碎片很多，之前可能是离心用了1500rpm有点高，但之后降到1000rpm,效果不明显，细胞损失特别大，希望大家能帮帮提提意见啊

niwanmao

你是想做胞内的抗原吧？甲醇破膜效果是很好，但对细胞损伤很大，所以一般目前不建议用。
首选商业化破膜剂，真要自己配，也是首选皂素，而不是甲醇。

大头

niwanmao 发表于 2015-9-11 20:26
你是想做胞内的抗原吧？甲醇破膜效果是很好，但对细胞损伤很大，所以一般目前不建议用。
首选商业化破膜剂 ...

嗯，我是做细胞胞内染色，好的，谢谢倪老师的建议，我再摸索一下条件

大头

niwanmao 发表于 2015-9-11 20:26
你是想做胞内的抗原吧？甲醇破膜效果是很好，但对细胞损伤很大，所以一般目前不建议用。
首选商业化破膜剂 ...

倪老师，细胞固定是用1%多聚甲醛还是4%多聚甲醛比较好啊，多聚甲醛是要现配现用吗？但是也有商业化的4%的液体多聚甲醛

niwanmao

大头 发表于 2015-10-13 16:23
倪老师，细胞固定是用1%多聚甲醛还是4%多聚甲醛比较好啊，多聚甲醛是要现配现用吗？但是也有商业化的4%的 ...

一般是1%。4%大多作为储存液，但是也不是完全禁止直接应用。

配置方法参见：
4%： http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1886-1-1.html
1%： http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-444-1-1.html

大头

niwanmao 发表于 2015-10-14 14:00
一般是1%。4%大多作为储存液，但是也不是完全禁止直接应用。

配置方法参见：

好的，谢谢倪老师

972676742

我们最近的一个实验，客户要求一定要用甲醇来破膜，甲醇处理后离心，细胞基本都看不到了，但继续加洗液（PBS+1%BSA）洗细胞后，反而又能观察到细胞沉淀了。后面再染色的话最好选择直接标记的抗体，减少细胞损失。
还有一个问题，每次弃上清的时候可以适当留100ul左右液体也能避免细胞损失太多。

niwanmao

972676742 发表于 2015-11-16 15:19
我们最近的一个实验，客户要求一定要用甲醇来破膜，甲醇处理后离心，细胞基本都看不到了，但继续加洗液（PB ...

甲醇处理后细胞看不到，但继续加洗液又能看到？这不符合实际啊，逆转啊

972676742

niwanmao 发表于 2015-11-16 17:57
甲醇处理后细胞看不到，但继续加洗液又能看到？这不符合实际啊，逆转啊 ...

这个样品做了好多次，之前甲醇处理后看见细胞很少甚至没有细胞就没继续往下做了，有一次就抱试试的心态继续做下去就能看见比之前那一步离心后细胞沉淀多了。

niwanmao

972676742 发表于 2015-11-17 08:35
这个样品做了好多次，之前甲醇处理后看见细胞很少甚至没有细胞就没继续往下做了，有一次就抱试试的心态继 ...

主要是要看最后获取到的细胞量对比。我个人觉得固定之后出现的沉淀增多那可能是因为碎片或蛋白之间发生凝集造成的，而不是细胞重新出现的缘故。其实在流式上获取的结果都应该是差不多的。