请教老师看看我做的流式图有哪些地方需要改进

Jing310

首先我用红细胞裂解液裂解全血，做的流式（机器是BD的canto II），阴性对照的图如下
问题有以下几个方便
1 FSC/SSC这张图，整体细胞往上飘，我电压用的是SSC：500；FSC：520；阈值用的16000，电压我也上下调整了，但好像用处不是很大。想问这种现象是可以调节好的还是跟本身细胞有关系？
2 图5,6都有一些细胞落在阳性区域，这是非特异结合？可以通过调节什么参数去除吗？还有图6好像不是很聚集在左下角，这是什么原因？
3 因为才刚开始接触，想了解下这几张图的质量水平处于什么位置?还有哪些可以改进的地方。

niwanmao

第一张FSC/SSC散点图碎片估计占90％以上吧，FSC的阈值需要继续加大，把这些碎片去掉。SSC的电压可以适当降低一点。

图5、6的那些少量信号是假阳性，可以认为是非特异性结合，排除掉死细胞和碎片，就干净了。
图6这个形状也是对的，不一定全部都是纯圆形。

把死细胞排除掉，就可以使结果达到高质量。

Jing310

同时用同样的样本提取PBMC做的，好像就没有怎么成群分布，正常的PBMC应该也能看到淋巴细胞和单核细胞的。
图1 是PBMC的FSC/SSC的图，想问一下这种原因是什么？是PBMC提取质量不够好还是参数没有调节好？
图2 是CD3单染的情况，想问下这种火箭状需要调节什么参数？还是细胞的问题？
图3 是PBMC提取后培养CIK细胞，第九天后上的流式图，碎片比较多，圈出来的应该是淋巴细胞吧？希望得到解答！

Jing310

niwanmao 发表于 2015-10-8 19:56
第一张FSC/SSC散点图碎片估计占90％以上吧，FSC的阈值需要继续加大，把这些碎片去掉。SSC的电压可以适当降 ...

谢谢老师，我会再调整看看。可否帮忙在看下2楼的图，万分感谢了！

niwanmao

Jing310 发表于 2015-10-8 21:02
谢谢老师，我会再调整看看。可否帮忙在看下2楼的图，万分感谢了！

2楼也是死细胞太多的问题，用死活鉴别染料排除掉死细胞就好了。

Jing310

niwanmao 发表于 2015-10-8 21:34
2楼也是死细胞太多的问题，用死活鉴别染料排除掉死细胞就好了。

老师再问一下，我选用CD3-percp，CD8-PE，CD56-PE-Cy7，这几个抗体，想问下这几个荧光选择怎么样？是否需要做补偿？

niwanmao

Jing310 发表于 2015-10-9 09:00
老师再问一下，我选用CD3-percp，CD8-PE，CD56-PE-Cy7，这几个抗体，想问下这几个荧光选择怎么样？是否需 ...

俩俩之间都需要做补偿。