流式菜鸟有很多问题。

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对不起各位，因为之前实验室完全没有做过这个方面，我什么都是自己摸索，可能有些问题很脑残，还请见谅。

我的实验室这样的，我做了一个提取物，为了给论文增加篇幅，做了细胞实验部分，主要是关于提取物的抗肿瘤的活性，其实我提取物的功效主要在抗氧化方面。可能这两方面都会做~  目前我在抗肿瘤部分基本算是停滞了 所以发帖求解答。

因为之前完全没有接触过流式，准确说 连养细胞实验室都没有人会~~~ 为了图方便也可以说是省钱吧，因为怕实验失败很多次。我买了碧云天的细胞周期与凋亡试剂盒。 试剂盒主要有一个配好的 PI RNase，还一个缓冲液。我按照试剂盒和碧云天的技术支持所说的是这样操作的。细胞是HepG2

1、我用的25cm小瓶子养的细胞，长满后，消化下来，吹成单细胞悬液按4000每孔种到6孔板中，然后1ml完全培养液。
2、第二天换培养液加药~ 用了五个浓度，因为提取液成分多，按mg/ml为单位~ 之前用MTT测EC50差不多是9.7mg/ml（作用48h，是的抗肿瘤活性真的一般~），我用的浓度是20mg/ml，10mg/ml，5mg/ml，2.5mg/ml和1mg/ml。
3、加药24h换液，还是换那个相同的浓度。后面是根据试剂盒操作
4、48h后，收集培养液在离心管中，加胰酶等细胞马上要变圆了，倒入之前收集的培养液。吹打均匀（不知道为什么6孔板特别不容易吹下来，大概吹了一百下），离心（实验室离心机老~ 就用了4000r/min）5min，弃培养液。
5、然后加入预冷的PBS重悬，用枪混均匀后再次离心，弃PBS。加入-20℃预冷的70%乙醇，重悬，在4℃冰箱中固定过夜。
6、第二天拿出来，发现细胞底部已经沉淀出来了~  还是离心，加1ml预冷的PBS重悬，离心后去掉PBS。再根据试剂盒配好染色液。加入染色液重悬避光37℃水浴30min。等流式检测。


流式细胞仪在别的校区，我用冰盒装好带过去等了几个人测好后，做流式的老师说她只做过一次细胞周期，不是很熟，特别怕堵了机器，然后问我过筛了没。。我说没过筛~ 之前不懂问碧云天说按试剂盒操作就好 不用过筛。。然后那个老师说没有过筛她不敢上机，就让我把样品那给她看看。。。 我把样品拿出来~  那个不争气的样品啊~~  直接沉淀在底部~ 就是上面是染色液~ 底部是枚红色的沉淀。然后老师就让我走了说样品必须澄清透明。让我问问别人这个怎么回事。。所以样品根本没有上机。。然后我去问医学院做细胞周期的同学，她说她们做有时候也会有这种玫红色沉淀，涡旋一下融进去就可以上机了。再回去那个老师已经下班走了 所以我那12个样品全部废了。

一大波问题来了：

1、平时用培养瓶细胞都很好消化，基本轻轻吹就可以掉下来。那个六孔板我做每一个孔都很难吹打下来，我觉得我那样吹打那么多下，细胞应该真的被折腾得不行了，估计就算当时上机了结果也不会好。虽然HepG2真的很皮实。是不是因为我没有用PBS洗，所以影响了。还是我该直接用细胞刮刮下来
2、我的离心转速真的太高了所以细胞容易成团？
3、做细胞周期我需要对细胞用血清饥饿法对吧~  这样比较好同步，之前全只看试剂盒操作书了 这些都不知道。
4、老师要求必须过筛，我买了一次性灭菌好的细胞筛，差不多是325目的，看到别人文献是用400目，也有200目的。我细胞最后沉淀出来是不是因为我没有过筛，那过筛的话是在消化细胞后过，还是全部染色好上机检测之前过筛。
5、样品要求澄清透明~ 我看了当时在那儿做实验的别的同学的~ 真的非常澄清透明~ 基本和水一样 什么都看不见~  当然他们做的不是细胞周期。我也不懂是什么。我的样品每次重悬后，感觉有点混混的感觉~ 有一点点雾雾的，绝对不是他们那样澄清透亮。而且每次重悬也不知道到底混均匀了没，总是觉得好多留在了枪头上~  能不能每次重悬直接涡旋混匀额。而且重悬之后细胞自己会沉淀下来这个真的不知道怎么办~是不是不管它，直接再悬起来上机。
6、对于平行不太懂~有的文献写重复三次实验得出数据，有的根本啥也没写，最后直接就有标准差算出来~。那是不是一个样品仪器可以测三次或者仪器一次就可以得到他周期的SD值~还是我需要准备复孔，每个浓度做3个平行，上机检测。
7、细胞周期那个有峰的图哟一直以为是仪器自己拟合出来的~ 逛了几天网站怎么好像是用软件~ OMG~
8、我种板用的是40000个细胞~  那提取物对细EC50是9.7mg/ml，那我浓度比较高的那两个组会不会细胞不够~ 需不需要设复孔。


我一直在想等细胞周期做成功了~ 再做个ROS~~ 也不知道难度是不是也这么大~~
真的太疑惑了~  各种问题太多~  真是麻烦了~  一只无助的菜鸟在呐喊~~为什么上机的样品底部有沉淀~~~~

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还有~~~  准备样品时，是不是要准备一个没有加染液的空白样品 和一个没有加药的对照样品

niwanmao

1、是否容易下来跟是否洗涤应该没有关系吧，具体原因需要你自己摸索一下。
2、与离心速度无关。
3、无需饥饿，你要做的是周期改变，而不是要周期同步。
4、滤一下可以避免堵塞机器，但是建议振荡一下看看，有沉淀就必须过滤，如果没有，只是混浊是可以上机的，低速获取即可。
5、可以混浊，混浊说明细胞多，可以稍微再加一点PBS稀释，但必须没有肉眼可见的团块。
6、建议重复三次，独立的三次，而不是同一个标本。
7、检测出来的结果需要用Modfit拟合，这样比较专业，直接在流式软件上用直方图当然也可以分析，但准确度欠佳。
8、需要。

niwanmao

317975145 发表于 2015-11-14 19:55
还有~~~  准备样品时，是不是要准备一个没有加染液的空白样品 和一个没有加药的对照样品 ...

准备样品只需做一个未加药的空白对照即可。

317975145

谢谢老师~  感觉自己纠结了这么多天一下子有了答案