foxp3染色问题求助

librahui · 发表于 2016-1-8 20:32:40

昨天做了Treg细胞的检测，是人外周血做的，但foxp3标记不上，不知道什么原因，向大家请教。
具体步骤是：1.100ul全血+2.5ulCD3+2.5ulCD8+5ulCD25 室温30min
                  2.每管1ml溶血素室温10min，离心然后染色缓冲液洗一次
                  3.每管1ml新鲜配置的fix/perm（1：3配置ebioscience）室温60min
                  4.之后加破膜buffer2ml 洗两次
                  5.加100ul破膜buffer重悬细胞之后加foxp3抗体5ul，室温60min
                  6.破膜buffer2ml洗一次，染色缓冲液2ml洗一次，加500ul染色缓冲液重悬上机
三张图分别是全血，CD3+CD8+CD25同型foxp3同型，全阳管，但感觉foxp3没染上，不知道什么原因，因为也一起做Th17，同样用的是foxp3的破膜剂，结果一直很好，但不知道为什么foxp3标不上，不知道是破膜原因还是抗体的问题。

niwanmao · 发表于 2016-1-9 20:43:49

全血那管是什么抗体都没加吗？全阴的。

foxP3很难稳定，关键还是在破膜剂，Th17之所以能做出来，因为IL17在胞内，不像foxP3在核内。不过抗体原因也不能完全排除。

librahui · 发表于 2016-1-10 10:30:17

是的，全血没有加抗体，那倪老师，我是需要把破膜时间延长吗，我就是怕核膜比较难破，平时都是45min，现在用一个小时，还有温度有没有影响，我是室温破的。@niwanmao

niwanmao · 发表于 2016-1-11 19:21:16

librahui 发表于 2016-1-10 10:30
是的，全血没有加抗体，那倪老师，我是需要把破膜时间延长吗，我就是怕核膜比较难破，平时都是45min，现在 ...

你买的破膜剂确定能破核膜？

librahui · 发表于 2016-1-12 08:26:05

niwanmao 发表于 2016-1-11 19:21
你买的破膜剂确定能破核膜？

是滴，是ebi专用的破核膜一共3瓶，我昨天还试着把破膜时间延长至1.5h，但仍是标记不上foxp3，不知道什么原因，急死了

缺血再灌注损伤 · 发表于 2016-1-12 10:44:48

会不会是抗体的问题，你问问实验室别人用这个抗体有染上的吗？

大头 · 发表于 2016-1-12 15:19:51

我们实验室一直用的是ebioscience的破膜盒子，能染上，而且破膜时间没有这么长

librahui · 发表于 2016-1-12 16:43:51

大头发表于 2016-1-12 15:19
我们实验室一直用的是ebioscience的破膜盒子，能染上，而且破膜时间没有这么长 ...

亲你是PBMC做的，还是全血做的，我是全血做的，做不出来

niwanmao · 发表于 2016-1-12 20:27:34

librahui 发表于 2016-1-12 08:26
是滴，是ebi专用的破核膜一共3瓶，我昨天还试着把破膜时间延长至1.5h，但仍是标记不上foxp3，不知道什么 ...

如果能够确定破膜剂没有问题，那么需要排除抗体问题。记得前段时间有个研究生做BrdU遇到类似的情况，用了某怎么品牌抗体，无论如何都做不出来，后来换了个名不见经传的牌子，反而做出了漂亮的图形。

librahui · 发表于 2016-1-13 07:48:12

niwanmao 发表于 2016-1-12 20:27
如果能够确定破膜剂没有问题，那么需要排除抗体问题。记得前段时间有个研究生做BrdU遇到类似的情况，用了 ...

恩恩谢谢老师，现在正在和试剂商沟通

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