凝结芽孢杆菌染cFDA问题

sharem

养的凝结芽孢杆菌，分了3管，那就是3个样本58号、59号、60号，每个样本做空白对照（不染色）和cFDA-SE单染，结果如下：
有些疑问58号、59号、60号三个的物理参数都不一样？但是是同一个菌液分开3个然后同样的操作的，这个很奇怪。
然后我实验的目的的想得到凝结芽孢杆菌的cFDA标记率是98%以上，58号是95%左右，59号、60号就差得远了，怎样做才能达到那个实验效果？有没大神做过这个？

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niwanmao

同一个标本，分成三份，做出这样的结果，只能说明你操作上的问题，染色不稳定。这应该是某些细节上的，需要好好摸索。

sharem

niwanmao 发表于 2016-2-16 09:46
同一个标本，分成三份，做出这样的结果，只能说明你操作上的问题，染色不稳定。这应该是某些细节上的，需要 ...

谢谢倪老师。这个实验是科研让做的，还要按他的方法步骤，我想了下，应该有几点容易有问题，
1、染色时是用4.9mL的菌液和100ul的cFDA混合，一共5mL的液体会造成染色不均匀么？但是第一管还是比其他好一些？
2、最后上机前没有加固定液多聚甲醛，只是加了点PBS，这样会不会是芽孢杆菌没甲醛固定就分裂了导致荧光不一样了？
3、每次离心的时间都是3000rpm，10分钟会不会过长了？

niwanmao

sharem 发表于 2016-2-19 09:48
谢谢倪老师。这个实验是科研让做的，还要按他的方法步骤，我想了下，应该有几点容易有问题，
1、染色时是 ...

从图中看，FSC相差这么大，感觉还需要排除标本粘连体的问题？用FSC-A/FSC-H散点图看看。另外，关于芽孢杆菌CFDA染色问题，可参考一下这篇文章
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=MTQxMTN8ZjcyYzllOTV8MTcxNjAwMDgwOHwwfA%3D%3D