同样的破膜剂，CD3 INF-gamma和IL4 结果千差万别是什么原因？

mcdfish

各位前辈，我染得是pbmc细胞，分别用conA和LPS刺激24h后，表面染了CD4-fitc，胞內分别染CD3，INF-gamma和IL-4，但是结果却相差甚远，能否帮我分析下我接下来该怎么改进？protocol：1. 刺激后收PBMC，PBS洗1-2次，350g，4°，5min；
2.弃上清后，加入鼠血清（40ul和80ul/管都试过），室温15min；
3.PBS洗2次，350g，4°，5min；
4.表面染色。加入CD4-fitc，室温25-30min；
5. 不洗，直接加IC fixation buffer 100ul，室温避光孵育20min；
6.permeabilization buffer 洗2次，500g，5min；
7.胞內染色，加入10ul抗体（CD3-647,或inf gamma-647或IL4-PE）,4°，50min；我重点关注了INF的，加了不同浓度稀释度的inf抗体。
8.PBS洗2次后，staining buffer重悬上机检测。

所有的抗体均为BD mouse anti-bovine的。破膜剂用的是eBioscience的IC fixation buffer。

结果：
1.之前INF-gamma背景高，就加入了鼠血清，但是发现没有效果，背景依然很高。降低抗体浓度除了降低荧光强度外，阴阳性并不能分开；之前用过PMA+离子霉素刺激也是这样的结果。
2.CD3可以染上。
3.IL4染不上，之前用过PMA+离子霉素刺激也是这样的结果。

24小时PBMC CD3：
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=OTY2NnxmZDI5NTJkY3wxNzMwNDIxMDM1fDB8

24小时PBMC IFN：
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=OTY2NXxmMDg3ZDhkZXwxNzMwNDIxMDM1fDB8


24小时PBMC IL-4：
https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=OTY2NHxkMjIyNjA0YXwxNzMwNDIxMDM1fDB8

mcdfish

附件是三种染色的结果，做了很多次实验，貌似牛的PBMC分群与人、鼠的是不一样的，画门应该不会错的。

mcdfish

没人回答么？

niwanmao

需要从两方面排除原因，一是抗体，二是破膜剂。
CD3因为是否破膜无关，而且表达丰度高，所以很容易出结果。
我觉得破膜剂首先关注一下，可考虑换一种破膜剂试试。

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-4-28 09:16
需要从两方面排除原因，一是抗体，二是破膜剂。
CD3因为是否破膜无关，而且表达丰度高，所以很容易出结果。 ...

恩   今天准备换一个试试   倪老师 您说我这个inf-gamma是背景高，还是没有染上呢？

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-4-28 09:16
需要从两方面排除原因，一是抗体，二是破膜剂。
CD3因为是否破膜无关，而且表达丰度高，所以很容易出结果。 ...

本来CD3染不上，后来给厂家发邮件，BD客服说应该破膜，真的破膜后就染上了，我也觉得奇怪

mcdfish

本来CD3也染不上，厂家说这个抗体要破膜，后来加了而eBioscience的破膜剂后果然就染上了，我也觉得奇怪。但是胞內就。。。。

niwanmao

mcdfish 发表于 2016-4-28 15:13
本来CD3染不上，后来给厂家发邮件，BD客服说应该破膜，真的破膜后就染上了，我也觉得奇怪 ...

你这几个抗体的克隆号分别是多少？

mcdfish

IL-4 PE  :CC303

INF gamma-647：CC302

mcdfish

niwanmao 发表于 2016-4-28 09:16
需要从两方面排除原因，一是抗体，二是破膜剂。
CD3因为是否破膜无关，而且表达丰度高，所以很容易出结果。 ...

换了BD公司的破膜剂还是不行，结果差不多