鸡血T淋巴细胞亚群的处理及检测中遇到的问题

winnebenben

      最近要检测一批鸡血,是做T淋巴细胞亚群的,之前也做过,但这次标本量比较多,而且带我的老师离职了,所以之前堆积的问题想求解一下,麻烦各位帮忙.        首先把实验材料及操作步骤先贴上来:

1、实验材料

     (1)实验设备及耗材：流式管、漩涡混匀振荡器、低速离心机、移液器、Tips、200目滤膜、流式细胞仪(BD FACSCalibur)

     (2)所需试剂

      1)荧光标记抗体Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD、Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、Mouse Anti-Chicken CD8a-PE （Southern Biotech）

      2)红细胞裂解液（BD公司）

      3)PBS溶液（TaKaRa公司）

2、实验操作步骤

     1）加抗体：取流式管，做好标记，分别吸取5ul的CD3、 CD8a抗体和3ul的CD4抗体加入到流式管底；

     2）加血：混匀肝素钠抗凝的鸡全血，吸取50ul血样品加入到流式管中，振荡混匀，避光孵育15min；

     3) 溶血：加入红细胞裂解液2ml，振荡混匀，避光孵育15 min；

     4) 洗涤：加入2ml PBS溶液，1100rpm×5 min离心；

     5）洗涤：弃去上清，重悬细胞，加入2ml PBS溶液，1100rpm×5 min离心；

     6) 过滤：弃去上清，重悬细胞，加入500ul PBS溶液，过滤准备上机；

     7) 上机检测：使用cellquest软件获取并分析数据。

操作过程中的问题：

1、鸡全血细胞溶血离心洗涤后有很多白色的肉眼看像细胞一样的东西，厚厚一层，重悬后均匀，无絮状沉淀及粗颗粒，可通过200目滤网，上机不会堵机器，但实际上CD3的比例很少，大部分都是一些不知什么东西，因为没有标记其他的抗体，也无从认证，有没可能是鸡红细胞是有细胞核的，白色的是溶血后红细胞的细胞核？

   下面是鸡血T亚群的FSC：SSC以及CD3+的图片，FSC：SSC一大堆细胞，但真正有CD3+的细胞就R1的那一点，左边还有一部分被我设置阈值切掉了。

2、由于细胞or颗粒太多，做的过程中时不时机器会死机，就是界面上一个细胞都没有，有点像堵了，但其实并不是，正常关机过一会儿再开机就又能正常使用了，这是什么原因？

3、由于标本太多（大概几百管），我能不能预先把三种抗体按比例混合，以减少逐个加抗体耗费的时间？会不会对图和结果有影响？

4、对方第一天采血，血样第二天才到我们手里，如果当天的血做不完，是否需要放4°C冰箱？怎样存放才能最大限度合理保存标本？

5、标记好的样本需要在多少时间内上机？我们没有固定液，以前试过今天标记好的样品做不完放4°C冰箱第二天检测，似乎对结果影响不大。

niwanmao

问题好多。大概回答一下。
抗体可以先混合好避光保存在4度，不会有问题。
标本需要放4度保存。标记好之后过夜再做，不建议这么做。
至于前面两点，其实意思差不多，从你描述的情况，应该是液路堵了，这对结果影响会很大，建议进行一次月维护的大冲洗，保证液路正常再测，否则你不但获取时不时取不到细胞，而且散点图上那些莫名其妙的信号会很多。

winnebenben

niwanmao 发表于 2016-6-8 14:16
问题好多。大概回答一下。
抗体可以先混合好避光保存在4度，不会有问题。
标本需要放4度保存。标记好之后过 ...

      谢谢倪老师，因为几乎都搜不到用鸡全血做流式的帖子，做了那么多次发现鸡血细胞溶血后真的很多不明颗粒，无法分离，而且流式图都是这样子，等下次做的时候po几张溶血后的图上来您就明白了。     之前工程师来看过说不是液路堵了，就是一下子当机了，可能一是标本颗粒太多，机器处理数据处理不过来，二就是我们的流式细胞仪年代久远，之前做小鼠样本也出现过这种情况，也是正常关机后过一会儿重启就又正常了。
     还有标本放4°C冰箱几天内要检测完毕才好？

niwanmao

winnebenben 发表于 2016-6-8 23:41
谢谢倪老师，因为几乎都搜不到用鸡全血做流式的帖子，做了那么多次发现鸡血细胞溶血后真的很多不 ...

不至于吧，如果获取数量太多首先应该会显示很快的流速才对。如果你真的看到很多颗粒，我觉得应该是其它原因，可以考虑用300目的滤网过滤一下看看。人的骨髓和外周血标本一般3－5天，鸡血标本估计也差不多吧。

winnebenben

niwanmao 发表于 2016-6-9 19:09
不至于吧，如果获取数量太多首先应该会显示很快的流速才对。如果你真的看到很多颗粒，我觉得应该是其它原 ...

好的~谢谢，还有之前听一个老师说过BD的溶血素中是含有固定细胞的成分的，溶血后无论洗涤与否都可以在4°C的条件下存放几天，具体几天没验证过，2~3天应该没问题，是这样吗？我们的溶血素都是买BD的临床抗体送的，这样标记好的细胞放4°C存放，然后2~3天内上机检测完毕是否会对结果有影响？还有为了节省时间我们流式细胞仪用的水是医院里生产的注射用水，没有用双重纯水蒸馏器制备双蒸水，PBS也试过但容易结晶，之前BD的工程师说还可以用哇哈哈纯净水，电阻率比较低，但没试过，请问可行吗？

niwanmao

winnebenben 发表于 2016-6-10 11:54
好的~谢谢，还有之前听一个老师说过BD的溶血素中是含有固定细胞的成分的，溶血后无论洗涤与否都可以在4°C ...

1、溶血素不管是否含固定成份，都不建议染色后保存。
2、水的问题不是很大。

winnebenben

niwanmao 发表于 2016-6-10 14:40
1、溶血素不管是否含固定成份，都不建议染色后保存。
2、水的问题不是很大。 ...

好的！谢谢倪老师！