th17 th22的流式检测方法

时光成熟

我现在要通过流式的方法染th17和th22细胞，请问染这两群细胞的gate strategy是什么？需要染哪些表面marker？
ps:看到网站中一些关于th17和th22的文章，都是在体外培养cd4+T细胞，通过细胞因子刺激分化为th17和th22，再进行流式检测的。而我希望了解的是如何用流式检测体内本来就存在的th17和th22？用哪些流式抗体来检测？
以上是我的问题，如能得到解答，不胜感激！

niwanmao

本身存在的th17和th22，可参考这个方案：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5394-1-1.html
也可以用胞内因子抗体检测，但因为涉及到破膜，由于破膜剂性能差异，所以容易出现结果不稳定的情况。

时光成熟

niwanmao 发表于 2016-10-28 17:49
本身存在的th17和th22，可参考这个方案：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5394-1-1.html
也可以用胞内因 ...

老师您好！还有几个问题：
1请问我如果想通过刺激的方法检测th17 th22的话  用pma和ionomycin可以吧？看文献一般刺激的时间是4-5小时，请问如果刺激的时间更长（比如过夜），这样实验的效果会有什么不同吗？
2另外抑制剂BFA是在刺激的最后一小时加入？还是在加入pma和ionomycin时就加入BFA？
谢谢您！

时光成熟

niwanmao 发表于 2016-10-28 17:49
本身存在的th17和th22，可参考这个方案：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5394-1-1.html
也可以用胞内因 ...

您说的胞内因子，是指th17 th22产生的il17 il22吗？用胞内因子检测，是指通过检测细胞因子的分泌情况 来检测这两种细胞？
那要检测这两个因子的话 也是需要刺激的吧？

niwanmao

时光成熟 发表于 2016-10-29 23:54
您说的胞内因子，是指th17 th22产生的il17 il22吗？用胞内因子检测，是指通过检测细胞因子的分泌情况 来 ...

你先明确想用什么方法检测，如果直接检测，建议还是用表面标记更稳定。如果需要刺激，站内有刺激方面的讨论帖，注意搜索。

zhenlai_zhu

时光成熟 发表于 2016-10-29 23:54
您说的胞内因子，是指th17 th22产生的il17 il22吗？用胞内因子检测，是指通过检测细胞因子的分泌情况 来 ...

加那些刺激不会改变细胞的分化状态（比如原来是Th1的，刺激之后胞内就会有更多的IFN-g，这样可以染流式胞内检测可实现，不然的话很难检测到的），其实不同的Th细胞的区分标准就是其分泌的细胞因子模式不同，Th17以分泌IL-17为代表，所以你刺激后，再用阻滞剂让这些细胞因子留在胞内，破膜后检测即可

时光成熟

zhenlai_zhu 发表于 2016-11-1 12:14
加那些刺激不会改变细胞的分化状态（比如原来是Th1的，刺激之后胞内就会有更多的IFN-g，这样可以染流式胞 ...

您的意思是  如果我想染TH17和TH22的话 还是刺激之后检测比较好？如果不刺激直接用表面标记来流式检测  想检测到TH17 和TH22比较困难？

niwanmao

时光成熟 发表于 2016-11-1 14:57
您的意思是  如果我想染TH17和TH22的话 还是刺激之后检测比较好？如果不刺激直接用表面标记来流式检测   ...

用表面标记检测的方案已经比较成熟，做起来也容易，前面已经介绍过那个方案了。
胞内因子建议还是需要刺激才能检测到高水平的表达。

时光成熟

niwanmao 发表于 2016-11-1 18:28
用表面标记检测的方案已经比较成熟，做起来也容易，前面已经介绍过那个方案了。
胞内因子建议还是需要刺 ...

嗯 看了站内表面标记TH17 TH22的帖子  但是帖子里您也说 像ccr6 cxcr3等趋化因子是比较广谱的表达  不是特异性的 容易导致比例增多。且我在pubmed中搜到的相关文献很多是用刺激的方法的 直接表面标记的文章找到的比较少（也可能是我找的文章比较局限）所以我想是不是刺激的方法检测更为准确呢？使用的更多呢？ 如果请您对这两种方法比较的话 哪种更为准确？

niwanmao

时光成熟 发表于 2016-11-1 19:16
嗯 看了站内表面标记TH17 TH22的帖子  但是帖子里您也说 像ccr6 cxcr3等趋化因子是比较广谱的表达  不是 ...

有其它标记组合鉴别，而且CXCR3和CCR6的分群有其特征性，还是特异性很高的。我前面给过你的链接是国际流式协会的官方杂志，还有一个Human Immunology Project均采用表面标记，怎么会不权威，不准确呢？