关于流式分析结果MFI的问题。

ruiyifeng

我想请教大家，我用质粒转染到HEK293细胞中，然后加1抗血清，2抗红色cy5.5标记物。从图像中可以明显区分患者血清IgG与质粒细胞结合并可以知道红色荧光强度的MFI的中值。但是根据文献提示，IgG指数的比例，是MFI转染细胞/MFI非转染细胞 ，结果大于3，则认为是阳性。我现在不明白，MFI非转染细胞如何正确的标记。参考文献是Updated estimate of AQP4-IgG serostatus and disability outcome in neuromyelitis optica。期待您的回复。左图为健康人， 中间为阳性患者，右边为阴性患者。  从IgG红色的百分比可以明显知道  健康人为0.阳性患者41.2，阴性患者为0.13。 我用红色为基准，区分阴性细胞和阳性细胞，并标记出不同的MFI平均值。  然后用阳性÷阴性，计算出IgG指数比例。但是意外的发现，从指数比例看与之前的百分比完全矛盾。阴性患者的指数为8，阳性患者是3.1.  根据文献表示，大于3 则认为是阳性。   但是这么一来，原本阴性的患者变成的阳性。  
我想知道是我的软件设置有问题，还是我的计算方式重现了问题。我用的软件是flowJoX10
请知道的老师们给予帮助。谢谢
图片如果看不清，可以参考附件内的图片。

钢蛋儿

很有意思的问题，我也在考虑这个疑问。。

这里有两个概念，一个是阳性细胞百分比，另一个是MFI比率（阳性细胞/阴性细胞的MFI）。
从网上流传的“FlowJo 中文实用手册”中的“Titration Data（一个抗体滴定实验的数据） ”来看，从 sample 8到 sample2，随着抗体浓度的增加，虽然阳性细胞百分比的变化趋势不规则，但是MFI比率却呈现递增趋势直至峰值的平台期（当抗体浓度为1时）。

那么问题来了，既然这两个概念的趋势大不一样，那我们做科研统计分析的时候该如何抉呢？

ruiyifeng

钢蛋儿 发表于 2016-12-2 15:18
很有意思的问题，我也在考虑这个疑问。。

这里有两个概念，一个是阳性细胞百分比，另一个是MFI比率（阳性 ...

这个是软件说明书上记载的方法示范。 从这里也可以看出，阳性的百分比 大约在30%上下，而对照组是0。从这里其实已经可以区分出阴性和阳性。  在同等阳性率的情况下样品3和8. 因为抗体浓度不同，所以MFI的比率不同。而我的结论恰恰相反，阳性率少的反而MFI值大，说明我图像处理上出了错误。但是我到现在没有找到可以正确处理图像分析的高手。

niwanmao

其实你可以把图形切换到PC5.5/SSC，就可以看阳性细胞可能是非特异性的信号，由于阳性信号少，而且可能是非特异性，于是就会表现出很高的MFI，所以会出现你所说的比例少却MFI高的矛盾问题。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2016-12-2 20:45
其实你可以把图形切换到PC5.5/SSC，就可以看阳性细胞可能是非特异性的信号，由于阳性信号少，而且可能是非 ...

倪老师，我认为平均荧光强度和阳性细胞百分比不一定是成正比的，或者说两者其实联系不大，所以两个指标得到的统计结果可以不一样的?
您觉得呢？

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2016-12-2 21:10
倪老师，我认为平均荧光强度和阳性细胞百分比不一定是成正比的，或者说两者其实联系不大，所以两个指标得 ...

我没说一定成正比啊，我只是觉得他这个图形可能是因为非特异性荧光造成的MFI异常增高。
平时无论是免疫分型还是其它检测上，百分比高并非意味着MFI高。

钢蛋儿

niwanmao 发表于 2016-12-3 19:58
我没说一定成正比啊，我只是觉得他这个图形可能是因为非特异性荧光造成的MFI异常增高。
平时无论是免疫分 ...

谢谢老师，有道理~~等等看这位同学最后怎么解决的，，

那我们分析的时候是该按照MFI还是百分比呢？感觉按照百分比的文献多一些
（其他地方看到“整体峰移应该按照MFI来分析”，但觉得仅这一条来决定用哪种有点太简单了）

只帆片影110

钢蛋儿 发表于 2016-12-3 20:44
谢谢老师，有道理~~等等看这位同学最后怎么解决的，，

那我们分析的时候是该按照MFI还是百分比呢？感觉 ...

所谓百分比，只要是阳性和阴性有明确的界限，从此界限算阳性的比例一目了然，其所受到的影响仅限于细胞表面是否表达靶抗原及抗体质量，但是MIF受到的影响相当多，例如抗体表面不同的荧光素标记，机器的电压条件，及样品制备过程，排除死细胞等均受到影响，如果是有标准操作流程的话MIF具有可比性，其意义较大，但如果没有的话要告知本实验室的各种操作过程，并严谨的排除死细胞等影响因素此时MIF值才有意义，总体来说，根据实验需要，如果仅仅需要判断阳性阴性那只需要阳性比例，但是如果同时如要判断不同条件对靶抗原的影响，则MIF也有重要意义。个人理解，仅供参考~

niwanmao

钢蛋儿 发表于 2016-12-3 20:44
谢谢老师，有道理~~等等看这位同学最后怎么解决的，，

那我们分析的时候是该按照MFI还是百分比呢？感觉 ...

@只帆片影110   说的比较完整了。对于流式来说，定量是其优势，一般情况下，百分比和MFI是没有严格要求必须采用哪个指标，关键在于看你对于实验结果的解读哪个更有利。如果真的要做到精确定量，还是需要用荧光参照微球做绝对荧光定量的，那种指标叫ABC，应该更靠谱。

ruiyifeng

niwanmao 发表于 2016-12-2 20:45
其实你可以把图形切换到PC5.5/SSC，就可以看阳性细胞可能是非特异性的信号，由于阳性信号少，而且可能是非 ...

感谢您的建议。我根据您的要求，重新做了一下分析，HEK293是无转染，A开头的是转染含有GFP的质粒，也就是说，转染后自带绿色荧光，二抗则为红色荧光标记物。N代表健康人，YQ代表阳性患者，KS代表阴性患者，从分析上的第三张十字图可以明显区分出YQ患者Q2阳性率为35%。而阴性患者和健康者Q2则不到1%。
根据第四张图，应该可以看出来这些红色荧光标记物的细胞为特异性细胞。根据红色标记的特异性细胞，我做了第5张图，计算MFI。但是问题出现了，健康人和阴性患者的MFI比率远远高于阳性患者，出现了第三张图结果和第五张图MFI比率结果的矛盾性。

首先，您先看看我分析处理的方式是否正确。
其次，根基您的建议我切换了pc5.5/SSC的图片，结果应该可以区分出来特异性。
由于阴性患者中的阳性细胞少，所以在计算MFI比率的时候可能会出现MFI偏高。  

根据文章所写，MFI比率是MFI AQP4-transfected cells/MFI nontransfectedcells，结果大于3为阳性。从字面意思看，未转染的细胞指的是哪一部分，在我的想法中，未转染的细胞应该不含有荧光或者含有微弱的荧光，也许是我的计算方式中的分子和分母，并不是文章中所提到MFI AQP4-transfected cells/MFI nontransfectedcells，所以计算的结果出现了矛盾。 我仔细研究了我的计算方式，是在转染的细胞中，如果出现红色绿色双标记的为阳性，单纯出现绿色的为阴性，然后用阳性/阴性，得出MFI的值。 如果我的分析的方式没有任何的问题，那我只能放弃MFI这种计算方式的结论，单纯用阳性率，体现患者和健康人的抗原抗体反应。@只帆片影110 @niwanmao