请教各位老师关于染5色分组的问题

Noddy

本人由于刚刚接触流式技术，所以想请教大家一个分组问题。现在想做染5色的，如APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10。按照我自己的理解我觉得可以这样分组：
APC-eFluor® 780单标：调补偿
                 PE-cy7单标：调补偿
                      APC单标：调补偿
        PerCP-Cy5.5单标：调补偿
                    FITC单标：调补偿
APC-eFluor® 780   FMO对照：只加4种抗体，即PE-cy7-B220；APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10；
                 PE-cy7  FMO对照：只加4种抗体，即APC-eFluor® 780-CD19APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10；
                     APC  FMO对照：只加4种抗体，即APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10；
        PerCP-Cy5.5  FMO对照：只加4种抗体，即APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD1d；FITC-IL-10；
                    FITC  FMO对照：只加4种抗体，即APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；

               样本管检测：加全部抗体，即APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10；

综上所述，大概需要做11管的量，由于第一次做流式，所以发帖来问下各位老师这个分组合不合理，或者有没有更好的建议呢？谢谢各位老师！

niwanmao

可以根据你要分析的指标进行微调。CD1d、IL-10我觉得应该很难染，可借用CD3 APC 和CD3 FITC代替调节。
至于FMO对照，要根据你分析的指标来定，例如你指分析不同B细胞亚群中的IL-10和CD1d，那么只需要设置这两个通道的FMO即可。

Noddy

niwanmao 发表于 2017-3-9 18:28
可以根据你要分析的指标进行微调。CD1d、IL-10我觉得应该很难染，可借用CD3 APC 和CD3 FITC代替调节。
至于 ...

倪老师您好，由于刚学所以不明白您说的“借用CD3 APC和CD3 FITC代替调节”这句话，能请您说具体点么？我是只分析IL-10和CD1d，那是否需要给IL-10和CD1d再分别设置同型对照呢？其他指标如CD19,B220,CD5这三个，因为是新手，所以还不知道这几个指标好不好设门，那么这三个指标不设置FMO是否也需要给他设置同型对照呢？

niwanmao

Noddy 发表于 2017-3-10 09:33
倪老师您好，由于刚学所以不明白您说的“借用CD3 APC和CD3 FITC代替调节”这句话，能请您说具体点么？我 ...

其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好，容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节补偿一言两语说不清，意思就是IL-10和CD1d这两个抗原表达量低，而且前者还需要破膜，所以他们对应的通道用这两个抗体不太合适，需要用强一些的抗原来代替补偿调节。

Noddy

niwanmao 发表于 2017-3-10 20:08
其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好，容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节 ...

倪老师您好，我同一个样本要检测两种细胞，一种细胞标记是：APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD1d；PerCP-Cy5.5-CD5；FITC-IL-10；另外一种细胞标记是APC-CD4；FITC-CD25；PE-Foxp3。按照您上面回复的意思，每一种颜色的补偿只需要加入一种抗体就够了（比如APC这个标记，我只需设置APC-CD4单标组，可以不设置APC-CD1d单标组补偿）？
所以我设置的单标补偿组就可以是APC-eFluor® 780-CD19单标；  PE-cy7-B220单标；APC-CD4单标；PerCP-Cy5.5-CD5单标；FITC-CD25单标；PE-Foxp3单标。总共6种单标补偿。
                                 

niwanmao

Noddy 发表于 2017-3-15 10:16
倪老师您好，我同一个样本要检测两种细胞，一种细胞标记是：APC-eFluor® 780-CD19；PE-cy7-B220；APC-CD ...

补偿是用单标，调节渗漏到附近通道的数值，但一定要采取高表达的抗原，你选择的这几个单标抗体中，CD25和FoxP3不行，前者表达阳性比例不高，而且强度也不高，后者需要破膜，也不适合调节补偿，可采用CD3 FITC和CD3 PE代替调节。

Noddy

niwanmao 发表于 2017-3-16 08:03
补偿是用单标，调节渗漏到附近通道的数值，但一定要采取高表达的抗原，你选择的这几个单标抗体中，CD25和 ...

那这个CD25表达阳性比例不高，而且强度也不高，需不需要给设同型对照呢？因为这个细胞只染3色，感觉没必要设FMO了，但是不知道有没有必要设同型对照。

niwanmao

Noddy 发表于 2017-3-17 09:21
那这个CD25表达阳性比例不高，而且强度也不高，需不需要给设同型对照呢？因为这个细胞只染3色，感觉没必 ...

你要分析的是Treg吧，那样的话不需要。
如果是要单纯分析CD25的表达率，那么建议用FMO对照或生物学阴性对照最佳。

Noddy

niwanmao 发表于 2017-3-17 20:16
你要分析的是Treg吧，那样的话不需要。
如果是要单纯分析CD25的表达率，那么建议用FMO对照或生物学阴性对 ...

是的，两种细胞都是分析细胞，并不是分析表达率。

Noddy

niwanmao 发表于 2017-3-10 20:08
其它三个指标CD19、CD5、B220分群很好，容易设门。
FMO对照只需要设置 IL-10和CD1d这两个通道即可。
调节 ...

倪老师您好，我这个检测有4个实验分组，每组5个样本。然后我想问您这种FMO对照是每个样本都设置?还是说样本的个体差异影响不大，一个实验分组设置一个就行了呢？