请教一下各位高手我这种结果是怎么造成的

Pukureus

我今天做了一次流式，想要检测一下细胞周期相关的一些因子的表达情况，但是我的Isotype出来的图像很怪异，之前没有遇到过这种情况，想请大家帮忙看看可能是什么原因。
我的大概流程是这样的：
1. 收集细胞，离心，70%乙醇4℃固定1h；
2.PBS+2%BSA洗涤两次；
3.PBS+2%BSA室温孵育30min封闭表面特异性结合位点；
4.一抗室温孵育30min，洗涤一次；
5.二抗室温孵育30min，洗涤两次；
6.过滤，上机。

我用的二抗是Cy5染料，实验组的图都不这样的，只有isotype非常怪异……

niwanmao

为何用70％乙醇固定？

Pukureus

niwanmao 发表于 2017-5-31 08:08
为何用70％乙醇固定？

写错了，是75%的乙醇，我觉得用乙醇的话固定和通透的目的都能够达到。

niwanmao

Pukureus 发表于 2017-5-31 08:40
写错了，是75%的乙醇，我觉得用乙醇的话固定和通透的目的都能够达到。

真不建议，乙醇对细胞形态和非特异性荧光影响很大，染DNA还好，染表面和胞内标记，结果就很容易出问题。
我不知道你做的是什么标记，目前的建议是：
1、用商品化固定破膜Kit。
2、使用生物学阴性对照。

Pukureus

niwanmao 发表于 2017-5-31 08:56
真不建议，乙醇对细胞形态和非特异性荧光影响很大，染DNA还好，染表面和胞内标记，结果就很容易出问题。
...

谢谢老师的建议，老师有没有什么用得比较好的商品化固定破膜kit呢，因为我们实验室之前都没有人做流式，我是第一个做的，一直都是拿乙醇来固定破膜的，之前听说有人是用4%多聚甲醛固定然后用皂素破膜的。

还有老师您说的生物学阴性对照指的是不加抗体的空白对照吗？

chymanhz

Triton X-100 (曲拉通 X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚。这个我们经常用。还有常用的一种破膜剂是CHAPS，没用过。

另外商业化的破膜剂ebio用过不错，其他的不知道

Pukureus

chymanhz 发表于 2017-5-31 11:11
Triton X-100 (曲拉通 X-100) 化学名称为聚乙二醇辛基苯基醚。这个我们经常用。还有常用的一种破膜剂是CHAP ...

非常感谢！我先试一下Triton X-100，要是做不好就买试剂盒了。

小憨

我觉得破膜还是个很关键的因素的，之前做T细胞的细胞因子染色时我发现，用破细胞膜的kit根本染不出来，但是用破核膜的kit（比如foxp3的kit）就染出来了。破膜剂的浓度和成分是个学问，像triton、saponin和chaps都是非极性表面活性剂（去垢剂），要是多了细胞直接就碎了，少了抗体又进不去，不知道有没有人研究过这个问题，借楼主这个话题跟各位老师讨论一下胞内、核内染色的问题。

niwanmao

小憨 发表于 2017-5-31 14:57
我觉得破膜还是个很关键的因素的，之前做T细胞的细胞因子染色时我发现，用破细胞膜的kit根本染不出来，但是 ...

确实，浓度非常关键。