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单核细胞氧化爆发能力的妙用

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发表于 2017-6-5 20:25:58 | 显示全部楼层 |阅读模式

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酒精性肝炎是酒精性肝病最常见的形式。 严重酒精性肝炎(SAH)发生严重和长时间的饮用酒精后,感染是SAH死亡率的重要因素。 25%的患者因感染而入院,另外25%在住院期间发生医院感染。目前还没有可用于预测感染发展的生物标志物,以指导抗生素使用并防止SAH感染死亡。

英国的Nikhil Vergis等人为了解释酒精性肝炎严重感染的易感性增加的原因,评估了单核细胞吞噬作用相关的信号通路及其可逆性,并分析了单核细胞吞噬缺陷是否可以预测随后的感染。
研究中,他们选择了42例严重酒精性肝炎患者的血液样本,使用CD14选择单核细胞,采用流式细胞术1,2,3-双氢罗丹明(1,2,3-DHR)分析单核细胞氧化爆发,胞吞作用也采用流式检测。

然而,文献中作者并没有把单核细胞吞噬功能和氧化爆发实验的过程、结果图形放出来,只放了统计学结果,所以,为此,我收集了相关检测Protocol及其结果,放出与大家分享。

吞噬功能检测
作者采用的是pHrodo这个生物学微颗粒,颗粒上面可以有大肠杆菌的抗原,带有绿色或红色荧光,与50ul全血(用RPMI 1640调至终体积100ul),37度,5%二氧化碳,孵育15~30分钟,即可检测绿色或红色荧光通道的阳性表达率,即可反映吞噬功能。
屏幕快照 2017-06-05 下午7.49.34.png
上图中,绿色是吞噬了pHrodo颗粒的细胞,可见随着加入的颗粒浓度增高,各类细胞均出现吞噬现象,阳性率可反映吞噬功能,并且可以看到5ug/ml以上,吞噬能力进入了平台期。


氧化爆发功能检测
400ul全血+4ml红细胞裂解液(174 mM ammonium chloride, 20 mMsodium bicarbonate, 1 mM EDTA)孵育裂解后,白细胞用Hank's缓冲液(含0.1%牛血清白蛋白)重悬,然后加入1mM EDTA、1U/ul catalase、100mM DHR染料。接着加入PMA至终浓度20ng/ml,孵育15分钟,就可以上机检测DHR荧光强度了。
正常人的氧化爆发结果图形如下:
屏幕快照 2017-06-05 下午7.55.11.png


这篇文献最后的结果发现:
在大肠杆菌感染时,SAH患者的单核细胞氧化爆发、产生超氧化物和细菌性杀伤等能力受损明显。治疗前单核细胞氧化爆发水平,可以预测两周内感染的发展情况,其灵敏度和特异性优于现有临床标志物。因此,单核细胞氧化爆发缺陷与第28天和90天的死亡相关。酒精性肝炎患者烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的gp91(phox)亚单位表达降低与单核细胞氧化爆发缺陷有关。单核细胞氧化爆发缺陷不受体内泼尼松龙治疗7天的影响。
对临床有指导意义的就是,对SAH患者,及时检测单核细胞氧化爆发能力,可预测感染的发生和发展。

因此,在临床上,检测一些功能性指标可能对于临床判断预后更有帮助。

文献源
Vergis N, Khamri W, Beale K, Sadiq F, et al. Defective monocyte oxidative burst predicts infection in alcoholic hepatitis and is associated with reduced expression of NADPH oxidase. Gut. 2017 Mar;66(3):519-529.

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