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DNA倍体检测新用处:对胃上皮异型增生的预后进行分层

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发表于 2018-7-6 12:47:32 | 显示全部楼层 |阅读模式

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异型增生(dysplasia)是组织病理学家先前用于描述胃肠道系统癌前病变的术语。胃的异型增生同消化道其他部分的异型增生一样,被定义为癌瘤形成过程中的非浸润性上皮改变。

胃上皮异型增生的自然病程和相应的监测策略在西方尚未明确定义。迄今为止,诊断均依赖于形态学,却没有可靠、可重复性的辅助方法(无论是免疫组织化学还是分子)确认胃上皮异型增生的诊断和/或危险分层。然而,制定客观和合理的监测指南却很需要这样的方法。

Kwun Wah Wen等人在Modern Pathology上发表了一篇《Use of DNA flow cytometry in the diagnosis, risk stratification, and management of gastric epithelial dysplasia》,采用福尔马林固定的石蜡包埋的胃组织,用流式检测DNA倍体。样本类型中,23例高度异型增生,38例低度异型增生,至于对照样本则来自同一人群的24个良性背景的粘膜。

处理方法
根据异型增生区域的大小,从组织块上切下3~4片 60um厚的组织,接着手动分出感兴趣的区域,以便提高异型细胞检出率。将样本放在组织活检袋。
准备开始DNA倍体样本时,将组织样品用100%二甲苯脱石蜡,并通过梯度乙醇、最后蒸馏水,使样本水化。
接着,将样本置于2ml含1%胃蛋白酶的PBS中,37度孵育一小时,接着加入10ml NST/bovine serum albumin (BSA) buffer (8.5g NaCl, 1.2g Tris Base, 0.111g CaCL2 *2H2 O, 0.123g MgSO4 *7H2 O, 0.5g BSA,用1L蒸馏水配制,pH 7.8),接着通过80um尼龙网过滤,1700rpm 2度离心10分钟,去上清,即可获得单细胞团块。
流式中文网注:对于粘膜组织,流式中文网原研的MagicFilter®魔滤,配合魔杵,可以提供更好的获取单细胞方案,10多秒~1分钟完成组织研磨和过滤,一气呵成
魔滤特写照片20180112.jpg 魔杵1个特写 nshn weixin 20180703-02.jpg

细胞团块以1ml DAPI工作液重悬,-80度摇床孵育过夜。
DAPI工作液配制方法:1ml NP-40加入1L 前述的NST/BSA Buffer,形成NST/NP-40/BSA buffer;取800ml NST/NP-40/BSA buffer,与200ml 106mM MgCl2、10mg DAPI、10% DMSO混合,如此获得NST/NP-40/DAPI储存液;NST/NP-40/DAPI储存液与含10%DMSO的NST/NP-40/BSA Buffer以1:4混合,即可获得DAPI工作液。

过夜后,细胞用枪头吹打散粘连细胞,如有团块可再次尼龙滤网过滤,最后上机检测。


检测结果
正常的胃窦黏膜,无异型增生:
屏幕快照 2018-07-06 上午11.24.04.png


低度异型增生:
屏幕快照 2018-07-06 上午11.24.26.png


有无DNA倍体异常,低度异型增生持续存在时间对比:
屏幕快照 2018-07-06 上午11.24.35.png


高度异型增生:
屏幕快照 2018-07-06 上午11.24.51.png


作者发现,DNA倍体异常(非整倍性或4N升高)的存在与异型增生水平增加相关,因为23例高度异型增生中18例(78%)检出DNA倍体异常,38例低度异型增生中检出5例(13%),而24个无异型增生的样本,则没有DNA倍体异常。

低度异型增生患者中出现DNA倍体异常的,1年和4年进展到高度异型增生或胃腺癌的概率分别为80%(p = 0.003)和100%(p = 0.005),而低度异型增生患者如DNA倍体正常,1年、4年和12年进展的概率分别为23%、32%和54%。因此,DNA倍体异常的低度异型增生患者进展为高度异型增生或胃腺癌的单变量风险比(HR)为6.9(p = 0.001)。在多变量分析中,男性、种族、息肉内镜外观、幽门螺杆菌感染和肠上皮化生等,与后续发生高度异型增生或胃腺癌的风险无显著相关。

在DNA含量异常的18例高度异型增生病例中,13例(72%)进展为胃腺癌,平均随访时间为9个月,HR为2.5,然而,这没有达到统计学意义。

总之,DNA倍体异常可以识别低度异型增生患者中的一部分,这些患者进展到高度异型增生或胃腺癌的风险增加,而且还可以提供形态学印象或怀疑高度异型增生的确证证据。更主要的是,这里采用了病理上福尔马林固定和石蜡包埋过的样本,使得临床检测的开展更容易了。


参考文献:
世界华人消化杂志. 2007-04-18; 15(11): 1181-1184
Wen KW, Rabinovitch PS, Huang D, et al. Use of DNA flow cytometry in the diagnosis, risk stratification, and management of gastric epithelial dysplasia. Mod Pathol. 2018 May 22. doi: 10.1038/s41379-018-0062-2.

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