Balb/c小鼠脾脏中CD4和CD8的检测比例不正确的原因？

我是二十

流式菜鸟遇到很多问题，希望各路大神能给予帮助和指导！
检测Balb/c小鼠脾脏中CD4和CD8细胞的比例。
首先去脾脏，研磨后，红细胞裂解15min，1500rpm，10min离心，随后孵育CD4-PE、CD8-PerCP荧光抗体30min，加入5mlPBS，1500rpm，10min离心洗涤抗体，弃上清，100ulPBS重悬细胞，上机检测。
但是发现很多问题，1.空白组汇中Lin模式下FSC和SSC的电压无论怎么调节细胞都不能明显分群？后来改成Log模式，那这样的细胞全体算是电压调节合适了吗？ 2.空白组中两个指标的电压和补偿调节的合适吗？ 3.随后同样的程序检测染色的样本为什么会整体上移？ 4.检测后的细胞比例不对会是原因呢？是抗体的量少吗？ 5.峰图中CD4和CD8阴阳性峰区分的不是很明显是什么原因呢？
问题比较多了，希望各位前辈能指导1

yahuicheng

能否看一下你的流式图，还有你用的是什么机器检测

我是二十

yahuicheng 发表于 2018-9-12 17:35
能否看一下你的流式图，还有你用的是什么机器检测

用的是guava easycyte流式仪

我是二十

yahuicheng 发表于 2018-9-12 17:35
能否看一下你的流式图，还有你用的是什么机器检测

稍等啊，我在传图片

我是二十

yahuicheng 发表于 2018-9-12 17:35
能否看一下你的流式图，还有你用的是什么机器检测

yahuicheng

我是二十 发表于 2018-9-12 17:43

我用的是BD Calibur的，调节FSC-SSC用lin就行，看你分群不明显，是不是抗体用量的问题

我是二十

yahuicheng 发表于 2018-9-13 08:56
我用的是BD Calibur的，调节FSC-SSC用lin就行，看你分群不明显，是不是抗体用量的问题 ...

那是抗体量少了吗？我有个疑问就是为什么我的空白未染色样本调节好程序之后染色的样本整个细胞会飘起来呢？对比两个图是不是电压发生了变化啊？

yahuicheng

我是二十 发表于 2018-9-13 10:04
那是抗体量少了吗？我有个疑问就是为什么我的空白未染色样本调节好程序之后染色的样本整个细胞会飘起来呢 ...

因为你用的模式一个是lin，一个是log

yahuicheng

我是二十 发表于 2018-9-13 10:04
那是抗体量少了吗？我有个疑问就是为什么我的空白未染色样本调节好程序之后染色的样本整个细胞会飘起来呢 ...

一般用之前抗体都是需要滴定一下的

我是二十

yahuicheng 发表于 2018-9-13 10:58
因为你用的模式一个是lin，一个是log

不是，我做了两个散射图，一个lin一个是log，我的意思是最右边的两个散点图，一个是空白组一个是染色样本，为什么会这么大差异，并且这个细胞比例不太对