流式补偿问题

cpu北极熊

              使用仪器是BD Canto plus,补偿设置使用的是补偿微球，仪器自动设置补偿。             发现的问题是：
                                 AF700和AF647的补偿是 AF700-AF647是96%，电压具体值记得不是很清楚，大概是AF700是400多，AF647是500多
                                  实际上样本时发现，设置了AF647通道的FMO，但是参照FMO设门的话会圈入比较多的阴性，与主观设门要差别很大。
                                  不知道是否是补偿设置或者是电压设置的问题，如果不是的话，FMO为什么会失去设门的意义呢？

cpu北极熊

希望可以得到各位老师的解答，谢谢！

niwanmao

需要看到数据才能判断。
FMO对设门帮助不大的情况，大多数是背景非特异性荧光太强，FMO主要是为了解决荧光渗漏的，背景荧光或死活细胞等原因引起的非特异性荧光无法排除。

cpu北极熊

niwanmao 发表于 2019-2-15 21:54
需要看到数据才能判断。
FMO对设门帮助不大的情况，大多数是背景非特异性荧光太强，FMO主要是为了解决荧光 ...

1：那如果不讨论FMO，只看补偿设置的话，AF700和AF647的补偿会有这么高吗？
2：我们封闭使用的是小鼠血清和人IgG，死活染料也染了，背景荧光是否可能是补偿过高引起的呢？
之前也学习了老师的其他帖子，提到过不适合的电压引起的高补偿，然后才想到FMO设门不适合会不会是因为电压和补偿调节的不合适引起的。
数据是指补偿数据还是散点图呢？
非常感谢老师的解答。

niwanmao

cpu北极熊 发表于 2019-2-16 08:10
1：那如果不讨论FMO，只看补偿设置的话，AF700和AF647的补偿会有这么高吗？
2：我们封闭使用的是小鼠血清 ...

我目前做的这些数据这两个通道之间没看到这么高补偿，但是不排除你那边电压设置不合理、仪器的滤光片设置不同等原因导致这么高的补偿。

背景荧光有很多因素，Fc非特异性结合、死细胞以外，还有细胞内部颗粒、色素等非特异性荧光影响甚大。