荧光蛋白和染料光谱重叠，我该怎么办?

chinals90

各位老师好！我年前订购了含有mcherry荧光蛋白的病毒，做流式的时候发现以前常用的7-aad/annexin v这两种染料光谱和mcherry重叠，除此之外我还要使用dilc1（5）这种染料，主要方向是检测凋亡，请问我该怎么办？重新定gfp荧光蛋白的病毒，还是换染料？ 换染料的话有什么可以替代的方案，刚刚迈上科研之路，没想到因为定病毒这一步选错了荧光蛋白给自己埋下了一个坑，谢谢各位老师！

niwanmao

chinals90 发表于 2019-2-25 23:35
这是实验室流式机器的通道，DILC1(5)选择APC通道，
pe标记的annexin v选pe通道，
7-aad选择percp-cy5.5，

可以。
调节补偿可以这样，设置几管补偿对照。
1、什么都不加，调节mCherry向PE和PC5.5通道的渗漏。
2、仅加Annexin V，调节PE和mCherry向PC5.5通道的渗漏。
2、仅加7-AAD，调节PC5.5和mCherry向PE通道的渗漏。

niwanmao

Annexin V用了什么荧光素？7-AAD发射647nm，mCherry 610nm，应该可以通过补偿调节的。

chinals90

niwanmao 发表于 2019-2-22 18:46
Annexin V用了什么荧光素？7-AAD发射647nm，mCherry 610nm，应该可以通过补偿调节的。 ...

Annexin V用的pe，我实验室的机器是bd的

niwanmao

chinals90 发表于 2019-2-23 19:41
Annexin V用的pe，我实验室的机器是bd的

DilC1(5)激发638 nm ，发射 658 nm，应该可以避开。
7-AAD  647nm
PE 578nm
mCherry 610nm
理论上是可以做的。

chinals90

niwanmao 发表于 2019-2-25 11:01
DilC1(5)激发638 nm ，发射 658 nm，应该可以避开。
7-AAD  647nm
PE 578nm

这是实验室流式机器的通道，DILC1(5)选择APC通道，
pe标记的annexin v选pe通道，
7-aad选择percp-cy5.5，
老师你看这样分配可以吗?
具体如何执行补偿呢?刚入门比较小白，谢谢老师耐心指点，谢谢！

chinals90

niwanmao 发表于 2019-2-26 11:19
可以。
调节补偿可以这样，设置几管补偿对照。
1、什么都不加，调节mCherry向PE和PC5.5通道的渗漏。

我所理解的老师的思路：
第一步什么都不加，调节mcherry，压到左下角的象限
第二步，仅加annexin v，细胞分为两团，压到左下和右下象限（主要是annxein v+要压到和第一步细胞团一致的高度）
第三步，仅加7-aad，细胞还是两团，压到左上和左下象限（主要是7-aad+细胞团要压到和阴性细胞团一致的坐标范围内），不知道我的理解是否正确，谢谢老师批评指正！