关于肺肿瘤转移小鼠肺免疫细胞流式的问题

luvianlamia

大家好，最近准备做肺里面的细胞分。机子是CytoFLE。问题有点多有点小白，麻烦大家了。

2、我是按照冷泉港的一篇文献来做的，它只用了含FBS的PBS，没有另外封闭，请问需要封闭吗？
3、这几个抗体分群能分开吗？设门需要做FMO对照吗？文献没有写它有没有用FMO。论坛里面的帖子说“荧光完全不重叠的通道之间不需要”，怎么看重不重叠？
4、我看有些文献方法（赛默飞的方法也是）细胞重悬是涡旋，会不会震死细胞？
5、我们实验室只有15ml角转子离心机，没有水平离心机，离心力用400g，5min，效果跟水平离心机是一样的吗？（好怕把细胞离死，之前用的300g，离不实，一倒上清细胞就丢好多QAQ）论坛和挺多文献都说是500g，离心三四次下来，会不会力太大了？
6、从取材到开始加抗体染色那一步，1h的操作时间会不会太久（因为小鼠样品比较多，如果分批染，结果会不会浮动太大？）
7、关于操作过程中温度的问题，PBS（含1%血清）要放在冰上预冷吗？还是全程操作都是室温，最后染色才放冰箱？8、染色的话，抗体都是eBio的，说明书有推荐用量，能不能100μL染色体积抗体浓度减半呢，或者染色体积用50μL（有些抗体是借的，怕用量太大，别的实验室试过说可以，但是我没做过）


PS：这是冷泉港的protocol
Multicolor flow cytometric analysis of immune cell subsets in tumor-bearing mice.

niwanmao

1、荧光通道是带通，所以即使不对，但只有荧光波长有重叠处，就能测的到信号。
2、用含FBS的PBS可以在一定程度上代替封闭作用，如果效果好就这样也行。
3、CD206连续性分布，其它几个都能分群
4、不会震死，但如果有可能，尽量短暂振荡，不要长时间放那里振。
5、离心不会死，放心。
6、建议小鼠先处理几只，全部做好，上机上好，再进行下几只，操作时间太长确实不好。
7、对于这些样本，可能全程放冰上比较合适。
8、减量可以，但尽量先行滴定和验证对比。

luvianlamia

niwanmao 发表于 2019-3-8 14:22
1、荧光通道是带通，所以即使不对，但只有荧光波长有重叠处，就能测的到信号。
2、用含FBS的PBS可以在一定 ...

好的，谢谢倪老师~