连续变化的表面标记应该如何设门？

luvianlamia

老师好，最近在准备做流式，查了很多资料。在做巨噬细胞的分型。巨噬细胞M1和M2有些分子标记的连续变化的，比如M2极化CD206是上调，CD80在M1是hi，在M2是lo。因为还没有上机做，但是按照查的资料来看，图形阴性和阳性应该是连成一片的，这种连续变化的标记应该要怎么设门？high和low的线怎么设定？

    我在researchgate看到一个关于连续变化的说法，但是不太理解
“Therefore, it's always better to look at changes in ratios, with the most useful ones being the iNOS/arginase ratio (easy to test in vitro with a NO assay vs an arginase assay, difficult to test in vivo) and the IL-12/IL-10 ratio (possible to test on ex vivo material with intracellular FACS).”

niwanmao

1、阴性和阳性之间的分界，以FC Block之后FMO对照为设门标准。不管其如何连接成片。
2、阳性部分的延伸，都算阳性，根据其扩展的Log级数，人为分出弱、中、高表达。

luvianlamia

niwanmao 发表于 2019-3-7 14:22
1、阴性和阳性之间的分界，以FC Block之后FMO对照为设门标准。不管其如何连接成片。
2、阳性部分的延伸，都 ...

谢谢倪老师的回答
FMO对照是超过两个颜色就要做吗？
CD45-PE，F4/80-AF488，CD11c-PerCPCy5.5，CD206-APC.四色荧光，就要做4管FMO对照对吗？
其中CD206是有连续变化的，那就是用扣除了CD206荧光的FMO设门吗？

另外，阳性高中低怎样人为划分呢？有大概标准范围吗？还是从划阴阳性的那里开始到阳性结束，均分3段？

niwanmao

luvianlamia 发表于 2019-3-7 16:19
谢谢倪老师的回答
FMO对照是超过两个颜色就要做吗？
CD45-PE，F4/80-AF488，CD11c-PerCPCy5.5，CD206-APC ...

因为CD206表达连续，所以单做它的FMO即可。其它三个抗体我记得应该是分群清楚的。

划分一般从阳性阴性分界开始，每一个Log算一个级别。

luvianlamia

niwanmao 发表于 2019-3-7 16:37
因为CD206表达连续，所以单做它的FMO即可。其它三个抗体我记得应该是分群清楚的。

划分一般从阳性阴性分 ...

嗯嗯，是的，其他三个是分群清楚的。
另外还有一个配色，是CD45,F4/80,CD80，只有CD80是表达连续的，做这个FMO就可以了吗？我看论坛里面帖子说是大于4色的做FMO。三色的要做吗？

另外，FMO对照是用于设门，单染管用于调补偿，做了FMO也还是要做单染管是吗？

niwanmao

luvianlamia 发表于 2019-3-7 16:46
嗯嗯，是的，其他三个是分群清楚的。
另外还有一个配色，是CD45,F4/80,CD80，只有CD80是表达连续的，做这 ...

三色如果通道相邻，建议还是做。
FMO对照是用于设门，但是前提还是需要事先Fc Block

luvianlamia

niwanmao 发表于 2019-3-8 13:57
三色如果通道相邻，建议还是做。
FMO对照是用于设门，但是前提还是需要事先Fc Block ...

嗯嗯，好的呢，还是做一下吧，买的抗体基本都是488激发，通道都太近了
谢谢倪老师