外周血或骨髓怎么固定、长期保存而不影响后期做流式检...

木棉

最近获得一份难得的婴儿白血病初发病人，希望多留一些血以备以后可能复查，有什么办法可以长期保存而不影响以后再做流式检测？  用甲醛固定？还是多聚甲醛？丙酮？75乙醇？，固定后冷藏还是冷冻，固定后检测的结果跟固定前有何差别？

niwanmao

提取白细胞，然后梯度降温，最后液氮冻存，这样时间最长。
其它保存时间都不够长。

木棉

niwanmao 发表于 2019-5-6 15:57
提取白细胞，然后梯度降温，最后液氮冻存，这样时间最长。
其它保存时间都不够长。 ...

怎么提取白细胞比较好呢？可以破红后离心去上清收集吗

niwanmao

木棉 发表于 2019-5-7 08:43
怎么提取白细胞比较好呢？可以破红后离心去上清收集吗

用Ficoll或Percoll提，取的时候，尽量把所有白细胞都取出来。

木棉

niwanmao 发表于 2019-5-7 10:48
用Ficoll或Percoll提，取的时候，尽量把所有白细胞都取出来。

谢谢倪老师，已经冻上了，查了一下第二层主要为单个核细胞，第三层为单个核细胞，为了尽量取出所有白细胞把两层液体都取出来保存了

xianluobo

niwanmao 发表于 2019-5-6 15:57
提取白细胞，然后梯度降温，最后液氮冻存，这样时间最长。
其它保存时间都不够长。 ...

倪老师，请问冻存是用DMSO10%+FBS90%吗，还是有哪种冻存液效果比较好？我之前用商品化的非程序性冻存液复苏后细胞都碎掉了

niwanmao

xianluobo 发表于 2022-12-14 11:39
倪老师，请问冻存是用DMSO10%+FBS90%吗，还是有哪种冻存液效果比较好？我之前用商品化的非程序性冻存液复 ...

冻存液通常是你说的这个成份，但是冻存的程序性降温非常关键，如果不遵守程序性降温，细胞特别容易死。

具体步骤：
按照胎牛血清和DMSO=9:1的方式配制冻存液（一般一根冻存管内1.8ml胎牛血清+0.2ml DMSO），4℃保存备用。然后，收集细胞，去上清后，用冻存液重悬细胞，接着依次4℃ 30分钟、-20℃ 2小时、-80℃过夜逐步降温（也可以采用自动化程序降温仪），最后转移到液氮罐中保存，实现长期保存。

xianluobo

niwanmao 发表于 2022-12-14 12:05
冻存液通常是你说的这个成份，但是冻存的程序性降温非常关键，如果不遵守程序性降温，细胞特别容易死。

...

倪老师，我取的小鼠血样量比较少，最近因为快递的因素抗体还要四五天才能到。我用的肝素抗凝，可以直接放室温或者四度等抗体到货吗？还是分离出PBMC进行固定，后面再标抗体上机？
哪种方法比较好呀，如果固定的话用4%多聚甲醛可以嘛？谢谢老师！

niwanmao

xianluobo 发表于 2022-12-27 16:33
倪老师，我取的小鼠血样量比较少，最近因为快递的因素抗体还要四五天才能到。我用的肝素抗凝，可以直接放 ...

之前在另一个帖子里面讨论过：
细胞固定保存问题
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-10219-1-1.html
(出处: 流式中文网)

srfts 站友分享过用固定破膜剂处理后，冻 -80度。你做的是表面标记还是胞内标记？如果胞内标记或核内标记，可参考srfts 站友的方法。如果做的是表面标记，则可仅用2％的多聚甲醛固定（但要确保表面位点不受多聚甲醛固定的影响）。

xianluobo

niwanmao 发表于 2022-12-28 08:34
之前在另一个帖子里面讨论过：
细胞固定保存问题
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-10219-1-1.html

谢谢倪老师的回复，我明白啦，我是做表面标记，看到您之前说CD4会受到影响，我不标CD4，这样我就固定试试啦