cd107a 和胞内染色

csadxm521

大家好，最近第一次做cd107a和胞内染色（两个实验设置的组别相同），分组如下：（CART细胞（CART阳性率40%左右）和肿瘤细胞共孵育，下面括号内为数量比）
1，CART：tumor（5：1）  2，CART：tumor（1：1）  3，CART+PHA-L       4,单独CART    5,T细胞：tumor（5：1）   6，T细胞：tumor（1：1）   
第一步，细胞共孵育1H后均加入BFA抑制剂，
第二步，检测CD107a的组别加入cd107a-fitc的抗体，接着孵育4H
第二步，检测胞内染色的组别不加入抗体接着孵育4H
第三部，收集细胞上清待检测CBA,细胞收集后做cd107a和胞内染色
cd107a：细胞离心后，加入ANTI-CART-PE和PERCP-CD8，孵育后上流式

胞内：细胞离心后，IFNG检测组加入CD8-APC /  CART-PE抗体染胞外marker，再用4%多聚甲醛固定，再用0.1%saponio破膜，再染PERCP-IFNG，流式检测

                             IL-2检测组加入CD8-PERCP /CART-PE抗体染胞外marker，再用4%多聚甲醛固定，再用0.1%saponio破膜，再染APC-IL-2 ，流式检测


补偿调节用PBMC单染调节


结果：CART检测结果（cd107a组和胞内染色组结果相似）：  单独

CART组（4）结果和以前一致，CART：tumor（5：1）组CART阳性率只有13%左右，其余组均检测不到CART阳性细胞

          cd107a检测：所有组别未检出

           胞内染色：IFNG所有组别未检出，IL-2CART：tumor（5：1）有检出4%（占CD8细胞的比例）左右（由于CART大部分组别检不出，只分析了CD8+细胞的部分）

问题：我不清楚是试验有问题？还是CART细胞都死掉了？

         

niwanmao

图形没有，看不出什么问题。

首先，细胞死活判断一下。
其次 ，破膜剂效果需评估。

tiger

皂素只能破胞膜。换Triton X-100 试试。

xusmilemen

niwanmao 发表于 2019-6-1 10:30
图形没有，看不出什么问题。

首先，细胞死活判断一下。

The Ax700-labeled, CD107a-specific reagent showed cytotoxicity at high concentrations (5ul and 10ul per 100ul staining volume) as measured by increased frequencies of dead cells. Therefore, almost no CD107a Ax700 signal was detected with these concentrations (Online figure 4A). In addition, optimal separating concentration of CD107a Ax700 at 1.25ul/100ul did not show considerably increased cell death but diminished cytokine responses (data not shown) likely due to cytotoxic sodium azide used as a preservative. Therefore, we decided to exchange the buffer with RPMI in order to eliminate the sodium azide from the CD107a Ax700 reagent.