请大家帮忙分析一下我做的CFSE细胞增殖数据

行棋无悔 · 发表于 2019-8-7 20:36:10

各位老师：
我前几天第一次做了CFSE细胞增殖实验，其大概是：分离鸡脾脏淋巴细胞，然后取2×107细胞重悬在0.5ml PBS中（置于15ml离心管，包裹锡箔纸）。在另一15ml离心管中加入5ml PBS，马上加入2ul CFSE储存液（5mM)，上下颠倒几下后，取0.5ml 稀释的CFSE溶液到0.5ml 细胞中（此时CFSE终浓度为1uM)，吹打几下后置于37度水浴10min，每隔2min晃动一次细胞。染色结束后加入5倍体积预冷的RPMI1640+10%FBS，置于冰上5min，300g离心6min，然后再用RPMI1640+10%FBS洗涤两次。最后计数细胞。24孔板每孔加一百万细胞阳性对照孔加入终浓度为5ug/ml的ConA，其他孔加入终浓度为15ug/ml的肽溶液。24孔板包裹锡箔纸后置于细胞培养箱中孵育4天。孵育结束后每孔加入终浓度为2mM的EDTA，室温作用10min，收集细胞进行CD4和CD8的表面染色，最后重悬在1%多聚甲醛中进行流式分析。结果如下图所示，不管是阳性对照还是样品孔均没有出现细胞增殖现象，都是单峰。请老师们帮忙分析一下是什么原因造成的，我可以从哪些方面进行优化？谢谢大家。
在此顺便请教大家几个问题：1、稀释CFSE的时候需要完全避光吗？关灯之后看得不是很清楚。
2、细胞铺板结束后可以在显微镜下看一下细胞密度吗？