一个单染（相当于）遇到的分群没有的困惑

潘潘杰

实验设计是这样的：两盘吞噬细胞，一个连接了荧光的微球（只有细胞吞进去后才会显gfp颜色，没有吞进去就不会显色的），一盘不加，24h培养后，用荧光显微镜看没有任何问题，如图1所示，当然不会每个细胞都吞，大概也就5%的比例，然后我想用流式去统计下吞进去的比例，其实相当于个单染而已，图2是不加微球的对照，图3是加了荧光微球的（补偿先不说），可是为什么没有清楚的两群呢，我把它们的FL1（GFP通道）柱状图叠加在一起（图4：这个图4不对劲啊），按理说应该像图5（这是别人文章中发的图，也是同样的实验）一样，加了荧光微球的分明显两群才对，大家可以帮我解答这个问题吗？谢谢大家啦，不甚感激。

潘潘杰

图片的编号对应上传后备注的图片序号，而不是.jpg前面的数字。

潘潘杰

图片顺序是倒着的，最后一张是图1，然后倒着看

niwanmao

从图中看，细胞吞了微球，但没发出光。
所以，我个人觉得需要从你的微球上找原因

潘潘杰

niwanmao 发表于 2019-9-5 08:40
从图中看，细胞吞了微球，但没发出光。
所以，我个人觉得需要从你的微球上找原因 ...

倪老师，图1是我准备跑流式上机前，从流式细胞管里面吸了20ul，滴了一个波片拿到荧光显微镜下看的，所以吞后发光这个是没有问题的应该，正常的结果就如别人文章里的那个图5，是阴性（没吞的）和一小群阳性（吞了的）两群才对，从我的结果上看，也就是图3，还是一群，虽然与空白对照（不加微球的那一群）明显的右偏了一些（柱状图），但是还是一群啊，当然我自己分析原因时，有一点就是发现细胞不管吞没吞，只要加了微球后，细胞的背景都会变绿，所以造成的分群不开。

niwanmao

潘潘杰 发表于 2019-9-5 10:17
倪老师，图1是我准备跑流式上机前，从流式细胞管里面吸了20ul，滴了一个波片拿到荧光显微镜下看的，所以 ...

是不是吞完之后，你没有进行PBS洗涤？

潘潘杰

niwanmao 发表于 2019-9-8 23:07
是不是吞完之后，你没有进行PBS洗涤？

洗过了，倪老师，用pbs洗过四遍，最后悬浮上机，而且其实它不吞进去，是不会有颜色的，也不会造成背景干扰，这种荧光染料是一种ph显色的，后来几天又重复了几次实验，还是没法解决这个问题。question: 1: 加了吞噬小球的这些细胞，fsc和ssc的第一个门，细胞的分布会和blank组不一样，ssc变大，说明吞了后细胞变大了。 2: 这个帖子只是我的第一个实验，后续的实验，是看一个基因是否对细胞的吞噬有影响。实验设计很简单：是在这个细胞里过表达一个基因，所以转入载体的时候，载体上连接了一个红色荧光（PE），细胞亮了说明过表达进去了，我最后统计红色细胞里有多少个绿色小球亮了就好，但是更棘手的问题是，不管是荧光显微镜还是流式细胞仪，fitc和pe交叉太大了，所以我用荧光显微镜看，用488激发，fitc通道看，一片绿，球也是绿的，细胞也是绿的，488激发，cy3通道看，一片红。根本无法区别开来，然后将细胞吹打下来跑FACS，补偿都没法调，就如这个帖子一样，就是单一的一群，根本分不开。

niwanmao

潘潘杰 发表于 2019-9-9 09:11
洗过了，倪老师，用pbs洗过四遍，最后悬浮上机，而且其实它不吞进去，是不会有颜色的，也不会造成背景干 ...

如果真像你上面那幅图像所示，不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪？

潘潘杰

niwanmao 发表于 2019-9-9 09:18
如果真像你上面那幅图像所示，不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪？ ...

贝克曼FC500

潘潘杰

niwanmao 发表于 2019-9-9 09:18
如果真像你上面那幅图像所示，不应该在流式上分不开啊。你在用的具体是什么型号的流式细胞仪？ ...

fc500确实不怎么好用啊，3通道是各种串色，而且倪老师，你看帖子中的3图，那个柱状图也好散点图也好，属于单一的一群吗？还是连续性表达的两群？