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有关标记Treg的FOXP3破膜是否过夜的问题

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发表于 2011-2-21 13:14:13 | 显示全部楼层 |阅读模式
1流星
我们实验室有的老师说标记好CD4\CD25以PBS洗涤后,加破膜液4度过夜,第二天再加FOXP3抗体孵育?这样行吗?还是破膜30分钟就标记FOXP3?

另外,我看到有的文献上说要加入稀释好的2%(2ul)的正常大鼠血清,可以省略这一步骤吗?

谢谢大家!

发表于 2011-2-21 13:57:15 | 显示全部楼层
一般标本的抗原随着时间的延长,多少会出现丢失现象,我估计你们老师可能是为了方便起见而建议你们这么做,但如果从标准操作来说,非常不建议这么做。而且,破膜剂作用这么长时间,也会对细胞表面的标记会有影响。

加入2%的大鼠血清,应该是起到封闭非特异性位点的作用。
发表于 2011-3-11 21:32:31 | 显示全部楼层
Foxp3染色时有一特殊的固定穿膜液(BD),可以允许4度穿膜过夜。
发表于 2011-3-14 09:03:05 | 显示全部楼层
我们做了很长时间的Foxp3了,我的感觉和第一个回答一样,破膜剂作用时间过长也会对细胞表面的标记会有影响,甚至细胞会破碎,应严格按照说明书的步骤操作。至于2%的大鼠血清加或不加没有差别,理论上说是封闭非特异性位点,实际上没有区别。这是我们的经验,仅供参考。

点评

感谢分享!  发表于 2011-3-14 09:42
发表于 2011-3-16 20:55:18 | 显示全部楼层
我也准备做Treg了,以后多请教
发表于 2011-3-16 21:03:53 | 显示全部楼层
发表于 2011-3-17 08:46:09 | 显示全部楼层
回复 niwanmao 的帖子
用FOXP3,订的是BD的kit

   
发表于 2011-3-20 10:32:11 | 显示全部楼层
估计如果是FOXP3,还是EBIOSCIENCE公司的用得多些,这个时候可以参照sakaguchi(发现Treg细胞的日本人)组发的文章,FOXP3通常用的是EBIOSCIENCE的,
另外,如果能检测FOXP3是精标准,CD127和CD25是间接的,是分选的时候没法用FOXP3标志的时候才用。当然,现在基本上CD4CD25FOXP3三标记就可以界定TREG

点评

感谢分享!  发表于 2011-3-20 10:50
发表于 2011-6-11 11:11:02 | 显示全部楼层
想请教一下各位,做Treg需不需要刺激呀,我们做的是不刺激的,结果做出来基本就是阴性结果,跟不刺激是不是有关系呀?
发表于 2011-6-12 11:44:52 | 显示全部楼层
不需要刺激,建议使用ebioscience的kit,还有eb固定破膜剂的效果也是很好的。
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